骨再生与间充质干细胞诱导成骨是目前医学研究的热门话题，选用适宜的支架材料作为载体控释或缓释药物诱导成骨是其中一个重要的研究方向。目前常用的成骨支架材料主要有不可吸收的聚甲基丙烯酸甲酯和可吸收的胶原蛋白、甲壳素、羟基磷灰石等。前者需要二次手术取出，后者的结构单一，载药能力不能达到理想要求，因此需要对传统支架材料加以改性或修饰才能达到载药的要求。本研究所用支架材料为微纳米修饰的羟基磷灰石微球颗粒，是由钙、磷和多种微量元素组成的生物活性陶瓷材料，与人体自然骨的无机质在化学成分和晶体结构上相似，可与自然骨形成牢固的化学结合，具有良好的生物相容性与骨传导性。同时，羟基磷灰石微球颗粒表面经过微纳米杂化修饰后提高了其比表面积，有利于吸附载药，不但可作为支架材料，还可作为药物递送载体，提高其骨诱导能力。　　茶黄素-3,3-没食子酸酯（Theaflavin-3,3-gallate，TF3）是由红茶中提取的一种多酚类物质，是茶黄素(theaflavins, TFs)的四种主要成分之一，其分子构成中特征性的苯并托酮结构也使TF3具备了一系列的治疗作用，具有抗氧化、抑制细胞突变、抗肿瘤细胞增殖、抗感染、抗病毒等特性。有国外学者研究发现，TF3可以抑制破骨细胞的前体细胞DNA甲基化从而抑制其向破骨细胞分化，达到减轻骨吸收的目的。但是把TF3应用于成骨研究，其对于成骨细胞有何作用及能否诱导骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨目前还未见相关报道。　　本课题的研究目的是观察纳米修饰羟基磷灰石（ Nano modified hydroxyapatite，Nano-HAp）微球颗粒负载TF3对于骨缺损的修复作用。研究中采用全骨髓贴壁法对大鼠BMSCs进行原代培养；探讨TF3促进BMSCs成骨分化的生物学作用及相关机理；通过合成Nano-HAp微球颗粒，构建负载TF3的纳米羟基磷灰石缓释给药系统，应用于大鼠股骨缺损，评价其体内成骨修复效果，为机体的骨缺损修复提供新的思路和方法。　　第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及诱导分化　　目的：全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs，对其细胞纯度进行鉴定，并检验其成骨成脂多向诱导分化潜能。　　方法：　　1 采用全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs，对获取的BMSCs进行原代培养与传代，镜下观察细胞的生长情况及形态变化。　　2 采用CCK-8法测定第3代BMSCs活力，根据每日获得的光密度值（Optical density, OD）绘制细胞的生长曲线。　　3 收集第3代BMSCs，分别加入PE标记的抗大鼠CD29、CD34、CD45、CD90，流式细胞技术进行细胞纯度鉴定。　　4 应用成骨培养基对第3代BMSCs进行成骨诱导，分别进行碱性磷酸酶（ Alkaline phosphatase, ALP ）染色及ALP活性定量检测和茜素红（Alizarin red, AR）染色及AR半定量检测，以鉴定其向成骨细胞分化的能力。　　5 选择第3代BMSCs进行成脂诱导，15天后进行油红O染色，鉴定其向成脂细胞分化的能力。　　6 统计学分析：采用方差分析比较各组之间的实验结果差异，P<0.05时认为具有统计学意义。　　结果：　　1. 成功进行BMSCs的原代培养及传代，原代细胞镜下最初呈圆球形，经传代后细胞形态发生变化，呈梭形、多角形、圆球形、不规则形等多种形态。　　2. 细胞生长曲线符合干细胞生长曲线特点，培养第3天至第5天为细胞快速生长期。　　3. 第3代BMSCs表面抗原鉴定结果：CD29的阳性表达率为100%， CD90的阳性表达率为96.9%，CD34的阳性表达率为0.7%，CD45的阳性表达率为0.8%，细胞纯度可达到实验要求。　　4. BMSCs经成骨诱导后，其ALP活性随诱导时间延长而增加，第3天、第7天、第10天各时间点之间的ALP活性均存在统计学差异（P<0.05）。其AR半定量结果亦呈现随时间递增的关系，第3天与第7天的AR半定量结果之间没有统计学差异，第14天的半定量结果要高于第7天，第21天的结果要高于第14天，且都有统计学差异（P<0.05）。　　5. BMSCs经成脂诱导15天后进行油红O染色，可在细胞内观察到橙红色脂滴样物质，出现成脂分化现象。　　小结：　　1. BMSCs生长曲线符合干细胞生长曲线特点。　　2. 通过流式细胞技术、成骨、成脂诱导分化能力鉴定，证实获取的BMSCs纯度可以达到实验要求。　　第二部分 茶黄素-3, 3-没食子酸酯对大鼠骨髓间充质干细胞的成骨机理探讨　　目的：检测TF3对大鼠BMSCs增殖的影响，探讨TF3对大鼠BMSCs成骨基因骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2, BMP-2）、I型胶原（ Collagen type Ⅰ, COL-I ）、Runt相关转录因子2 （ Runt-related transcription factor 2, Runx2）和骨钙素（Osteocalcin, OCN）以及成血管基因血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF），血管生成素 1 （ Angiopoietin-1, ANG-1 ）的mRNA表达水平的影响以及诱导BMSCs成骨分化的相关机理。　　方法：　　1 利用高效液相色谱仪（High-performance liquid chromatograph, HPLC）分析TF3样品的纯度。　　2 采用L-929细胞株，对TF3进行细胞毒性反应分级试验。　　3 不同浓度TF3溶液作用于大鼠BMSCs后，CCK-8法测定细胞增殖情况，选择合适浓度的TF3溶液应用于后续实验。　　4 不同浓度TF3作用于大鼠BMSCs后，分别于第3、7、10天进行ALP染色及ALP活性定量检测。　　5 不同浓度TF3作用于大鼠BMSCs后，于第21天进行AR染色及AR半定量检测。　　6 不同浓度TF3溶液作用于大鼠BMSCs后，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)方法检测TF3对大鼠BMSCs成骨基因、成血管基因表达的影响。　　7 应用不同浓度TF3溶液作用于大鼠BMSCs后，采用蛋白印迹法（Western blotting）检验BMP-2信号通路蛋白的表达；随后阻断BMP-2信号通路，应用TF3作用于大鼠BMSCs，检验BMP-2信号通路阻断后其通路蛋白的表达。　　8 不同浓度TF3溶液作用于大鼠BMSCs后，通过Western blotting技术检验丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路蛋白的表达；然后阻断MAPK信号通路，TF3作用后检验其下游蛋白Runx2和OCN蛋白的表达。　　9 统计学分析：采用方差分析比较各组之间的实验结果差异，P<0.05时认为具有统计学意义。　　结果：　　1. 所购TF3样品经HPLC检测分析，其纯度可达98.04%。　　2. 10μM浓度TF3的细胞相对增殖率（Relative growth rate, RGR）为111.49%，细胞毒性级别为0级；100 μM浓度TF3的RGR值为87.64%，细胞毒性级别为1级；1mM浓度TF3的RGR值为55.83%，细胞毒性级别为2级。　　3. 经成骨诱导后，BMSCs的增殖活性下降，与0 μM组相比，0.1 μM、1 μM、5 μM、10 μM浓度TF3可以不同程度的促进BMSCs增殖，而20 μM与40 μM浓度组则明显抑制BMSCs增殖。　　4. TF3溶液处理后，ALP染色结果与TF3溶液浓度呈递增效应，ALP活性定量结果与TF3溶液浓度及处理时间均呈正相关。　　5. TF3溶液处理后，AR染色及半定量结果均与TF3溶液浓度呈递增效应。　　6. 经RT-qPCR方法检测，TF3作用可上调BMSCs成骨基因BMP-2、COL-I、Runx2和OCN的表达水平，最佳浓度为10 μM；同时可上调成血管基因VEGF和ANG1的mRNA表达水平，最佳浓度为5 μM。　　7. 各浓度组TF3可上调通路蛋白BMP-2、p-Smad1/5、Runx2及其下游蛋白OCN的表达水平，与0 μM组之间均有统计学差异（P<0.05），各通路蛋白的表达量均与TF3的浓度呈递增效应。用通路阻断剂Noggin处理后BMP-2、p-Smad1/5、Runx2、OCN蛋白的表达水平均有不同程度的下降，与TF3组之间存在统计学差异（P<0.05），但表达水平均高于0 μM组，并且有统计学差异（P<0.05）。　　8. TF3可提高MAPK信号通路中细胞外信号调节激酶（Extracellular signal regulated protein kinase, ERK ）蛋白和p38蛋白的磷酸化水平，对c-Jun氨基末端激酶（C-Jun amino-terminal kinase, JNK）蛋白的磷酸化水平没有影响。ERK途径与p38途径被阻断后，下游蛋白Runx2与OCN的表达水平下降，低于TF3组水平，有统计学差异（P<0.05），但是高于0 μM组水平，有统计学差异（P<0.05），阻断JNK通路后Runx2与OCN的表达水平没有明显变化，与阻断前无显著性差异。　　小结：　　1. 低浓度TF3可促进BMSCs增殖，而高浓度TF3可抑制BMSCs增殖。　　2. TF3可促进BMSCs成骨因子和成血管因子的基因表达。　　3. BMP-2信号通路参与了TF3诱导BMSCs成骨分化的过程。　　4. MAPK信号通路中的ERK途径与p38途径参与了TF3诱导BMSCs成骨分化的过程。　　第三部分 纳米修饰羟基磷灰石负载茶黄素-3,3-没食子酸酯促进大鼠股骨缺损修复的研究　　目的：合成Nano-HAp材料，构建表面负载TF3的Nano-HAp缓释给药系统，应用于大鼠股骨缺损，评价其体内成骨修复效果。　　方法：　　1 采用前驱体水热转化技术合成Nano-HAp微球颗粒，并于电镜下观察其表型特征，应用X射线衍射仪（X-ray diffraction, XRD）测试其表征物相及结晶度。　　2 分别用Nano-HAp负载浓度为100 μM及1000 μM的TF3溶液，构建TF3缓释系统；高效液相色谱法检测TF3缓释系统的缓释性能，制作缓释曲线。　　3 动物实验：实验动物分为三组：A组：Nano-HAp组（n=6）；B组：Nano-HAp/TF3-100组（n=6）；C组：Nano-HAp/TF3-1000组（n=6）。8周龄SD雄性大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉，于其双侧股骨外上髁制作直径3.5 mm，深度4 mm的骨缺损，依分组分别植入Nano-HAp、负载TF3浓度为100 μM及1000 μM的Nano-HAp。　　4 于术后8周处死动物，取股骨进行Micro-CT检测，分别比较各组样本骨缺损区的骨体积分数（Bone volume/tissue volume, BV/TV）、骨小梁数量（Trabecular number, Tb.N）、骨小梁分离度（Trabecular space, Tb.Sp）和骨矿化密度（Bone mineral density, BMD）。　　5 取股骨标本，4℃下多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察组织学表现，Image Pro 5.0图像分析软件进行图像分析并计算新骨形成面积。　　6 统计学分析：采用方差分析比较各组之间的实验结果差异。P<0.05时认为具有统计学意义。　　结果：　　1. 场发射扫描电子显微镜（ Field-emission scanning electron micro-scope，FESEM）下显示合成的Nano-HAp形貌为球状，直径120～150 μm，高倍FESEM视野下显示Nano-HAp微球表面布满直径为50～80 nm，长度1～2 μm的纳米线结构。XRD分析结果显示合成产物完全符合纯HAp物相。　　2. Nano-HAp 微球颗粒具有持续的药物缓释能力，初始 3 h 内Nano-HAp/TF3-1000 组缓释率要高于 Nano-HAp/TF3-100 组， 3 h 后Nano-HAp/TF3-1000组缓释率要低于Nano-HAp/TF3-100组。　　3. 应用 Micro-CT 重建股骨损伤部位的新骨形态，与不载药的Nano-Hap组相比，Nano-HAp/TF3-1000组与Nano-HAp/TF3-100组的BMD数值增高，BV/TV与Tb.N数值亦都高于Nano-HAp组，进行单因素方差分析及两两比较都存在统计学差异（P<0.05）。Nano-HAp/TF3-1000组与Nano-HAp/TF3-100组的Tb.Sp数值要低于Nano-HAp组，进行单因素方差分析及两两比较亦都存在统计学差异（P<0.05）。　　4. HE染色结果分析：Nano-HAp微球脱钙后遗留有较多的空白腔隙，腔隙周围可观察到不同程度的新骨形成。Nano-HAp/TF3-1000 组与Nano-HAp/TF3-100组新骨形成面积百分比要高于Nano-HAp组，将三组新骨形成面积百分比进行单因素方差分析并两两比较发现，三组结果之间均存在统计学差异（P<0.05）。　　小结：　　1. 成功构建了Nano-HAp/TF3药物缓释系统。　　2. 负载TF3的Nano-HAp能够促进股骨缺损的修复。　　结论：　　1. 低浓度TF3可促进BMSCs增殖，而高浓度TF3可抑制BMSCs增殖。　　2. TF3可促进BMSCs成骨因子和成血管因子的基因表达。　　3. BMP-2信号通路参与了TF3诱导BMSCs成骨分化的过程。　　4. MAPK信号通路中的ERK途径与p38途径参与了TF3诱导BMSCs成骨分化的过程。　　5. 成功构建了Nano-HAp/TF3药物缓释系统。　　6. 负载TF3的Nano-HAp能够促进股骨缺损的修复。