2003年初爆发的全球性流行的严重急性呼吸系统综合症(Severe AcuteRespiratory Syndromes，SARS)被确诊为是由一种新型冠状病毒(SARS冠状病毒)感染引起的疾病。SARS 3CL蛋白酶是SARS冠状病毒复制过程中的关键酶，被认为是基于结构的抗SARS药物设计的重要靶标。SARS爆发伊始，本实验室就开展了一系列的基于SARS 3CL蛋白酶的药物设计研究。研究3CL蛋白酶的结构与功能的关系有助于理解其产生催化活性的机制，为基于该酶的药物设计提供有用信息。研究发现，SARS 3CL蛋白酶在溶液中以单体和二聚体的混合物形式存在。进一步的实验证明SARS 3CL蛋白酶形成二聚体是其形使活性的前提，基于这个发现我们提出了可以通过抑制SARS 3CL蛋白酶二聚体形成来抑制该酶活性的观点。围绕着SARS 3CL蛋白酶二聚体这一有趣现象，本论文进行了深入的酶性质、机理及针对二聚界面的药物设计研究。 首先克隆、表达和纯化了SARS 3CL蛋白酶，并用定点突变的方法确认了His-41、Cys-145是SARS 3CL蛋白酶的催化活性位点。接着用分析型超速离心的方法精确测得了SARS 3CL蛋白酶的二聚体解离常数为14.0 μM。这一结果将有助于我们理解其二聚体与催化关系的机制。利用定点突变的方法发现了对SARS 3CL蛋白酶二聚体形成起重要作用的关键残基Arg-4和Met-6，这一结果为我们设计二聚体抑制剂提供了重要信息。 设计了将野生型的酶与各种突变体进行杂交的实验。通过与野生型亚基结合形成杂合形式的二聚体，突变体H41Y、H41Y/D187A表现出较强的激活野生型蛋白酶的能力；而突变体．H41Y/D289A，以及结构域缺失突变体3CLc、3CLh表现出抑制蛋白酶活性的能力。为了进一步证明这种杂合二聚体具有活性能力，我们运用PCR方法构建了共价连接的杂合二聚体，活性实验证明该共价连接的杂合二聚体具有活性。综合杂合二聚体的活性实验与分子动力学模拟的结果，我们认为SARS 3CL蛋白酶二聚体中的两个亚基是不对称的，特定时刻只能有一个亚基有活性，且两个亚基之间不太可能发生构象互变。我们提出了SARS 3CL蛋白酶可能遵循“二聚一激活一催化一解聚"的催化机制。 因此，SARS 3CL蛋白酶二聚体抑制剂有可能是一种有效的抑制该酶活性的方式。我们运用本实验室自己开发的蛋白质功能嫁接的方法，搜索了具有与SARS3CL蛋白酶潜在结合能力的蛋白质，我们从中挑选了人类白细胞介素6作为嫁接骨架蛋白。初步实验结果表明，白细胞介素6的突变体S170E能够明显的抑制SARS 3CL蛋白酶的活性。此外，还设计了基于荧光共振能量转移的SARS 3CL蛋白酶的大蛋白底物。我们用大肠杆菌表达纯化得到设计的荧光蛋白底物，成功建立了基于该底物的测活方法，并进行了初步的抑制剂抑制能力测试。同时我们还把该蛋白底物引入到大肠杆菌细胞中，通过与蛋白酶的在细胞内共表达，实现用荧光检测细胞内的活性，以此建立了一个基于荧光的大肠杆菌活体测活体系，通过引入野生型蛋白酶和无活性的突变体蛋白酶验证了该活体测活体系的效果。这个测活体系具有潜在的高通量抑制剂活体筛选和蛋白酶进化筛选的应用价值。