玉米（Zea mays L．）是世界上重要的粮食、饲料兼能源作物，也是重要的遗传模式植物。在我国，玉米产量仅次于水稻，在国民经济中占有非常重要的地位。玉米粗缩病（Maize Rough Dwarf Disease，MRDD）是严重危害玉米生产的一种病害。在我国引起玉米粗缩病的病原为水稻黑条矮缩病毒，灰飞虱为主要传毒媒介。为了控制病害流行，减少生产损失，开发和利用玉米本身的抗病基因，进行抗病育种和遗传改良，是从根本上解决病害问题的有效途径。目前国内外对玉米粗缩病抗病基因的研究没有突破性进展，其制约因素主要有玉米植株的抗病性鉴定难度大和缺乏适用于抗性基因定位的群体。一、玉米粗缩病人工接种和分子检测技术的建立本工作利用灰飞虱为传毒媒介，以山东济南地区自然发病的典型的玉米粗缩病植株作为毒源饲喂灰飞虱。将经过饲毒培养的灰飞虱随机分成3组，每组由若干样本组成。第一组中每样本含有灰飞虱1头，第二组和第三组中每样本分别含灰飞虱5头或10头。样本匀浆液利用间接酶联免疫方法检测RBSDV含量，进而确定灰飞虱的带毒率。对第一组12个样本检测，有3个样本为阳性，得出灰飞虱带毒率为25％。检测每样本含有5头灰飞虱的第二组样本，得出灰飞虱带毒率为13.3％。由10头灰飞虱组成的样本均表现出阳性结果。因此，人工接种时每株小苗应接种10头灰飞虱，确保在接种的灰飞虱中至少有一头携带有RBSDV。在此基础上，以感病自交系掖478为材料，分别研究了植株发育时期（叶龄），接种的虫口密度和接种时间这三个因素对人工接种效果的影响。结果表明：玉米植株早期易感病，人工接种后发病率高；当虫口密度为15头和10头灰飞虱接种二叶期的掖478幼苗时，发病率可分别达到100％和96％；以每株10头灰飞虱的虫口密度接种掖478幼苗时，接种期长，发病率高。根据上述的实验结果和在不同接种条件下玉米植株的存活率，得出适宜的接种条件为：二叶期玉米植株、每株15头经过饲毒的灰飞虱和接种期5天。采用适宜的接种条件同时接种了90110、掖478、M017、掖515、8112、鲁源92、P138、178、F112132和F022411等10个自交系，得出90110、P138、178和F022411为抗病自交系，掖478为高感自交系，掖515、鲁源92、F112132和8112为中度感病自交系。这些自交系人工接种鉴定的结果与3年的田间鉴定结果相一致，但田间鉴定发病率较人工接种发病率低，而且不同年份间波动较大。利用间接ELISA和荧光定量RT-PCR两种方法分别检测了人工接种的90110、掖478、F112132和F022411植株中的病毒含量。间接ELISA方法不能明确区分健康植株和发病较轻的1、2级植株，但能将发病较重的3级病株鉴定出来。荧光定量RT-PCR方法可以稳定地检测出在100ng总RNA中的1×103拷贝的病毒RNA，能够区分出病级不同的植株。根据定量RT-PCR检测结果可得出，感染了RBSDV的植株并不都表现出玉米粗缩病症状，但就总体而言，不同病级的植株平均病毒含量之间存在显著的差异，在感病自交系中植株的RBSDV含量越高，发病程度越重，病毒含量为1×10³拷贝／100ng总RNA的植株可定为感病植株，而病毒含量为1×10⁶拷贝／100ng总RNA的植株可定为严重感病的植株。即利用荧光定量RT-PCR方法可以准确地检测出植株的病毒含量，确定植株的抗病性。玉米粗缩病人工接种鉴定体系的建立可使植株抗病性鉴定工作摆脱了田间环境因素波动的制约，得到稳定可靠的鉴定结果。将人工接种鉴定和荧光定量RT-PCR检测方法结合起来，可以在一个分离群体中准确鉴定发病植株和抗病植株，有助于玉米粗缩病抗病基因定位。二、掖478×90110的分子标记连锁图谱构建以高感玉米粗缩病的我国的玉米骨干自交系掖478为母本，以高抗玉米粗缩病的自交系90110为父本构建作图群体，取掖478×90110的150个F₂单株构建分子标记连锁图谱。在筛选的86个RFLP标记和456对SSR引物中，双亲间表现多态性的标记共有347个，多态频率为66.0％；无扩增产物的SSR引物有16对；多态性稳定的RFLP标记59个。挑选出26个RFLP标记和252对SSR引物进行F₂群体的单株分析。对于共显性标记，与90110带型相同的F₂单株赋值为A，与掖478带型相同的F₂单株赋值为B，具杂合带型（同F₁带型）的赋值为H；对于显性标记，与90110带型不同的F₂单株赋值为C，与478带型不同的F₂单株赋值为D；缺失记为“-”。将每一标记在F₂群体中的分离数值与其相应的孟德尔理论分离比例（显性3：1、共显性1：2：1）相比较，进行X²适合度检验，验证每一标记的分离是否符合孟德尔比例（即：是否表现为偏分离）。汇总RFLP和SSR标记在F₂群体中的分离数据，用MAPMAKER／EXP3.0软件构建分子标记连锁图谱。在278个标记中，有271个标记被分别划分成10个连锁群中。大部分标记在本图谱上的位置及排序与它们在玉米基因组数据库（MaizeGDB）的IBM Neighbors map 2004图谱上的相同。本图谱覆盖玉米基因组（总长）2164.3 cM，标记间平均距离为7.98cM，形成了自交系掖478×90110的分子标记连锁框架图，可用于主效基因定位以及QTL的初步分析。本图谱为玉米粗缩病抗病基因的分子标记定位奠定了良好基础，对发掘双亲之间其它优异农艺性状基因资源具有重要价值，对于掖478的大量衍生自交系的遗传改良也具有重要的意义。三、利用分离群体定位玉米粗缩病抗病位点通过人工接种鉴定和田间自然发病鉴定两种方法，对自交系90110、掖478及其F₂群体、BC₁群体和部分重组自交系群体进行了玉米粗缩病抗病性鉴定。两种鉴定方法得到了一致的可以相互验证的结果。在F₂群体中，莱州地区鉴定材料的自然发病率为14.6％和13.3％；济南地区鉴定材料的自然发病率为14.0％和12.7％；人工接种鉴定材料的三次重复的发病率分别为14.0％、14.0％和18.0％。在BC₁群体中，莱州地区鉴定材料的自然发病率为36.0％和35.3％；济南地区鉴定材料的自然发病率为33.3％和31.3％；人工接种鉴定材料的三次重复的发病率分别为36.0％、40.0％和35.0％。对F₂和BC₁群体中抗、感植株的比例分别进行了卡方检验，得出在掖478×90110这一组合中，粗缩病抗性不符合由一个或两个基因控制的简单的遗传模式。37个重组自交系的人工接种鉴定结果与三年的田间自然鉴定结果相一致，不仅确定了这些自交系的粗缩病抗性，而且进一步验证了人工接种鉴定的可重复性。取15株抗病的F₂植株的DNA等量混合组成F₂抗池，10株严重感病的F₂植株的DNA等量混合组成F₂感池；15株抗病的BC₁植株的DNA等量混合组成BC₁抗池，15株严重感病的BC₁植株的DNA等量混合组成BC₁感池。先用构建分子标记连锁图谱的SSR标记检测F₂抗池和F₂感池，再用在F₂抗池和F₂感池之间表现出多态的SSR标记检测BC₁的抗池和感池。对于那些在BC₁的抗池和感池之间表现出多态且与在F₂的抗池和感池之间的多态相一致的标记，初步认为它们可能与玉米粗缩病抗病基因连锁。通过SSR-BSA分析，我们找到了4个与玉米粗缩病抗病基因连锁的分子标记，分别为6号染色体上的umc1656（bin6.02），7号染色体上的umc1401（bin7.02），8号染色体上的bnlg1823（bin8.07）和umc1268（bin8.07）。由于这4个标记分别位于6、7、8染色体上，且抗病植株的SSR带型在这些位点上与自交系90110的相同，推测在90110中至少存在3个玉米粗缩病抗病位点，分别以Mrdd1、Mrdd2和Mrdd3表示。根据F₂分子标记连锁图谱，我们选取了6号染色体上的umc1656、umc1006、umc1083、bnlg2191和umc1595共5个SSR标记，7号染色体上的umc1401、umc1695、umc1666和umc2142共4个SSR标记，8号染色体上的bnlg1823、umc1268、umc1728、umc2014和umc1032共5个SSR标记，检测了150个经过抗病性鉴定的F₂单株。通过比较抗病位点与其附近每一SSR标记之间的共分离比率，确定了在所选择的SSR标记中，umc1656、umc1401和bnlg1823分别是与Mrdd1、Mrdd2和Mrdd3距离最近的标记。利用共分离分析，Mrdd1位点被定位到标记umc1656和bnlg2191之间，在F₂分子标记连锁图谱中umc1656和bnlg2191之间的遗传距离为4.5cM；Mrdd2位点被定位到标记umc1401和umc1666之间，在F₂分子标记连锁图谱中umc1401和umc1666之间的遗传距离为11.1cM；Mrdd3位点被定位到标记bnlg1823和umc1268之间，在F₂分子标记连锁图谱中bnlg1823和umc1268之间的遗传距离为5.8cM。四、利用重组自交系群体验证玉米粗缩病抗病位点的定位结果根据F₂群体中玉米粗缩病抗病位点定位结果，选取与每一抗病位点最近的分子标记及这个标记两侧的标记检测了重组自交系群体中的18个抗病株系和19个感病株系。利用检测这些重组自交株系的数据对每个抗病位点进行共分离分析。在重组自交系群体里，Mrdd1位点被定位在umc1656和bnlg2191之间；Mrdd2位点被定位在umc1401和umc1666之间；Mrdd3位点被定位在bnlg1823和umc1268之间，结果与利用F₂群体中数据的定位结果完全一致，确证了Mrdd1、Mrdd2和Mrdd3位点为玉米粗缩病抗病位点，并且来自于抗病亲本90110。另外，重组自交系群体检测结果表明，一个抗病株系至少要有两个来自于90110的抗病位点才能表现出抗病表型。本工作对玉米粗缩病抗病基因进行了初步定位，确定了3个抗病位点在染色体上的位置，这在基因组水平上证明了玉米粗缩病抗性是至少由3个基因控制的性状，为玉米粗缩病抗病基因的精细定位奠定了基础。鉴定出的与抗病位点连锁的分子标记可用于抗玉米粗缩病的辅助选择育种。