生姜茎叶多糖的结构解析、体外消化酵解和保肝活性研究

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多糖(Polysaccharides)是由单糖单元通过糖苷键连接而成的一类重要生物聚合物。目前,已从植物的根、茎、叶、花以及果实等组织中分离得到多种不同活性的多糖。植物多糖不仅具有低毒副作用,且对于改善人体健康和治疗疾病具有极大潜力。已证实植物多糖具有抗氧化、保肝、消炎、抗肿瘤、降血糖血脂和血压、增强免疫以及益生等生理功效。因此,从新植物资源中探寻具有生物活性的多糖类化合物是近些年科研工作者聚焦的热门方向。生姜(Zingiber officinaie Roscoe),又称为地辛、姜根、百辣云等,是一种姜科姜属的多年宿根草本植物。我国生姜资源丰富,每年的生姜生产量和出口量稳居前列。在生姜采收和加工的过程中会产生大量生姜副产物,如采收副产物生姜地上部分的茎叶和加工副产物姜皮及姜渣,这些副产物目前大部分会被直接丢弃,造成了严重的资源浪费和环境污染。近年来,国内外陆续报道了一些关于生姜、姜皮和姜渣中活性多糖的研究,然而关于采收副产物生姜茎叶中多糖的制备、结构解析及其生物活性的研究几乎是空白。因此,为了提高生姜茎叶的综合利用价值,可以从利用率低的生姜茎叶中提取活性多糖并对其具体的生物活性功效进行体系化研究,以期为生姜茎叶活性多糖的开发和利用提供理论支撑,这对姜农增收、企业获利和资源高附加值转化具有重要意义。基于此,本论文以重庆地区的生姜茎叶为研究材料,利用不同提取工艺制备生姜茎叶多糖,并对多糖的理化性质、抗氧化活性、结构解析、体外模拟消化酵解特征进行系统性研究,并根据肠-肝轴理论结合肝脏转录组学和肠道微生物组学探讨生姜茎叶多糖对酒精性肝损伤的保护作用及机制。本论文具体结论归纳如下:(1)提取工艺对生姜茎叶多糖理化性质和抗氧化活性的影响采用热水提取(Hot water extraction,HWE)和超声辅助提取(Ultrasonic-assisted extraction,UAE)两种工艺制备生姜茎叶粗多糖(Ginger stems and leaves,GSLP),探讨HWE和UAE工艺对生姜茎叶粗多糖的理化性质和抗氧化活性的影响。结果表明:与HWE制备的生姜茎叶粗多糖(HWE-GSLP)相比,UAE制备的UAE-GSLP具有更高的得率,更高的总糖、糖醛酸和硫酸根含量;同时,UAE-GSLP的分子量分布相对更小,平均粒径更小,Zeta电位绝对值更大,表观黏度更低;此外,UAE工艺制备的UAE-GSLP表现出更强的ABTS+·自由基、DPPH自由基、OH自由基和O2·-自由基清除活性以及Fe2+螯合作用。综上,宜选择UAE法制备GSLP用于后续的试验。(2)生姜茎叶多糖的分离纯化和结构解析采用纤维素阴离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析法对GSLP进行分离纯化,并利用多种表征方法对GSLP的纯化组分进行结构解析。结果表明,经柱层析法分级后共获得五个生姜茎叶多糖GSLP组分,以其中的纯化组分GSLP-3和GSLP-4作为后续实验研究材料;GSLP-3和GSLP-4的平均分子量分别为83.75k Da和31.96 k Da,总糖含量分别为86.25%和85.65%,糖醛酸含量分别为3.74%和5.23%;GSLP-3和GSLP-4均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖这8种单糖组成,但对应单糖的摩尔百分比有显著差异性;由高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析和核磁分析结果表明,GSLP-3主要由α-L-Araf-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、6)-β-D-Galp-(1→、→3,6)-β-Galp-(1→、→6)-α-D-Galp-(1→、β-D-Galp-(1→、→3)-β-D-Galp-(1→、β-D-Xylp-(1→和→4)-α-Galp A-(1→2这9种糖苷键构成,而GSLP-4主要由α-L-Araf-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→、→2)-α-D-Araf-(1→、→6)-α-Galp-(1→、→3)-β-Galp-(1→、→3,6)-β-Galp-(1→、→2,4-α-L-Rhap-(1→、α-Xylp-(1→、→3)-β-D-Galp A-(1→和→3,4)-α-D-Galp A-6-OMe-(1→这10种糖苷键构成;圆二色谱和原子力显微镜结果表明GSLP-3和GSLP-4在水溶液中呈现较大颗粒的聚合体形态;刚果红实验结果表明,GSLP-3具有三股螺旋结构,而GSLP-4不具有;X衍射结果表明,GSLP-3和GSLP-4主要以无定型形态存在。(3)生姜茎叶多糖组分的体外模拟消化和酵解特征研究通过体外模拟口腔、胃部和小肠消化实验研究多糖组分GSLP-3和GSLP-4的消化特征,同时通过体外模拟人体粪便菌群的酵解实验来研究GSLP-3和GSLP-4的酵解特征。结果表明,多糖组分GSLP-3和GSLP-4在模拟的口腔、胃部和小肠消化体系中具有较好的稳定性,主要表现在GSLP-3和GSLP-4的平均分子量和还原糖没有发生显著性变化,且没有游离单糖产生;在酵解体系中发现GSLP-3和GSLP-4酵解48 h后分别有43.30%和58.27%的碳水化合物被分解消耗;同时GSLP-3和GSLP-4在体外酵解过程中明显降低体系p H值,并显著提高总短链脂肪酸含量,尤其是乳酸、乙酸和丙酸含量;GSLP-3和GSLP-4能够干预酵解过程并在门和属等水平上改变肠道菌群结构,促进宿主肠道健康,在门水平上,GSLP-3和GSLP-4均显著增加厚壁菌门(Firmicutes)丰度,并抑制梭杆菌门(Fusobacteria)的增长;在属水平上,GSLP-3和GSLP-4显著提高了肠道菌群中部分有益菌的相对丰度,GSLP-3显著提高了肠道菌群中部分有益菌巨球型菌属(Megasphaera)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度,而GSLP-4则显著提高了Megasphaera、巨单胞菌属(Megamonas)和Bifidobacterium的相对丰度,二者多糖组分均显著降低了有害梭杆菌属(Fusobacterium)的相对丰度。这些结果表明GSLP-3和GSLP-4作为潜在的益生元,均能够调节肠道菌群稳态,从而减少因肠道菌群紊乱而诱发的疾病。(4)生姜茎叶多糖GSLP-3对酒精性肝损伤小鼠的保护作用及其机制以活性更优的生姜茎叶多糖GSLP-3为原料,通过饲喂液体酒精饲料建立C57BL/6J品系雄性小鼠的酒精性肝损伤模型并测定肝损伤相关的生理生化指标,同时利用转录组学和微生物组学联合分析技术来探讨GSLP-3对酒精性肝损伤的保护作用及其机制。结果表明:GSLP-3能降低肝损伤小鼠的肝重指数并促进小鼠体重恢复正常;GSLP-3可显著提高肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性,并降低血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性;GSLP-3也能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性并降低丙二醛活性,同时可缓解肝脏中脂质水平的异常变化,降低脂肪堆积和变性;GSLP-3可以显著降低小鼠血清中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的基因表达量以及分泌量,同时减少内毒素含量,从而缓解炎症反应,改善肝脏损伤状况。依据肠-肝轴理论,进一步分析GSLP-3对酒精性肝损伤的保护作用机制为:由GO和KEGG富集分析筛选出与免疫炎症和信号传导相关的五条主要信号通路,分别为NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、趋化因子信号通路、PI3K/AKT信号通路和NF-κB信号通路,通过验证相关富集基因的表达水平可知GSLP-3能缓解机体的炎症免疫反应,对酒精性肝损伤起到保护作用;从肠道菌群角度分析GSLP-3对酒精性肝损伤的保护作用可知,GSLP-3可显著降低变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度,而显著提高疣微菌门(Verrucomicrobia)的丰度,可增加有益菌阿克曼菌(Akkermansia)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度,同时降低有害菌埃希氏-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)的丰度。
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