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目的:在前期研究中已经证实,产丙酮酸棒状杆菌(Corynebacterium pyruviciproducens,C.pyruviciproducens,CP)及其肽聚糖(CP-PGN)作为 Toll 样受体(Toll-like receptors,TLRs)成员TLR2的配体具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant aureus,MRSA)感染的功能,本研究主要探索 CP-PGN 与TLR2识别结合后,如何通过调节后续信号转导过程而发挥抗感染的作用。方法:1.小鼠尾静脉或腹腔注射MRSA构建血流感染和腹腔感染模型,经过CP-PGN处理后,记录小鼠的感染状态和生存时间,绘制生存曲线,qRT-PCR检测脾脏、肺脏、肝脏等脏器中Toll样受体途径中的核心调控因子髓样分化因子(Myeloid differentiation primary response 88,MyD88)的 mRNA 水平变化。2.取小鼠原代腹腔巨噬细胞在体外模拟MRSA的感染,CP-PGN在MRSA感染前和感染后作用,分别模拟预防感染和治疗感染模型。Western blot和ELISA法检测CP-PGN处理前后MyD88表达水平和细胞因子TNF-α、IL-6分泌水平的变化。3.小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7经过CP-PGN不同浓度和时间刺激后,Western blot和ELISA法检测MyD88表达水平和TNF-α、IL-6分泌水平的变化,评价CP-PGN对核心因子MyD88和细胞因子影响的浓度和时间依赖性;同时CCK-8法检测试验过程中细胞活性有无变化。4.CP-PGN分别作用在小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7 MRSA感染前后,Western blot和ELISA法检测MyD88表达水平和细胞因子TNF-α、IL-6分泌水平的变化,在细胞模型中分析CP-PGN针对MRSA的感染预防和治疗作用,以进一步验证CP-PGN抗感染作用过程中所引起的TLR2-MyD88途径中分子机制和细胞因子的变化。5.CP-PGN与MyD88抑制剂ST2825分别对小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7作用,qRT-PCR检测TNF-α、IL-6 mRNA表达水平的变化,以探讨在MyD88调节过程中,CP-PGN和ST2825作用机理的区别和联系。6.Western blot法检测CP-PGN作用小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7引起TRIF表达水平的变化,探讨CP-PGN抗感染免疫调节机制中是否涉及TLR-非MyD88依赖途径。7.通过干扰RNA si-MyD88降低小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7中MyD88表达,Western blot和ELISA法检测CP-PGN作用后引起的MyD88表达水平和细胞因子IL-6分泌水平的变化,进一步明确MyD88基础水平是否参与影响CP-PGN的调节作用。结果:1.CP-PGN能够提高小鼠血流和腹腔感染MRSA的生存率,但是MRSA肽聚糖(M-PGN)的干预却加重了 MRSA感染小鼠的死亡率,qRT-PCR检测结果显示与严重感染小鼠相比,轻微感染小鼠脾脏等重要脏器中MyD88 mRNA水平显著降低,说明MyD88的适度表达水平影响到感染的进展,但是这是否与CP-PGN的干预有关需要进一步确定。2.体外感染MRSA引起小鼠原代腹腔巨噬细胞MyD88蛋白表达水平升高,但是随后CP-PGN的作用能够逆转这一趋势。3.CP-PGN能够以浓度和时间依赖性的方式降低小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7中MyD88的蛋白表达水平,并伴随TNF-α、IL-6表达水平的增高;与Toll样受体(TLRs)的其他配体MRSA全菌体、M-PGN、TLR2激动剂Pam3CSK4相比,CP-PGN对MyD88的抑制作者用最为明显,且整个实验中细胞活性无明显差异。4.Western blot结果显示,在细胞系RAW264.7上模拟CP-PGN预防MRSA感染模型,CP-PGN能够降低RAW264.7中较高的基础MyD88表达水平,且在MRSA感染后继续维持较低水平。在感染治疗模型中,MRSA感染后作用的CP-PGN能够降低感染所致的MyD88水平增高,并伴随TNF-α分泌水平的回落。5.qRT-PCR检测结果显示CP-PGN与MyD88抑制剂ST2825引起细胞系RAW264.7中TNF-α和IL-6相反的变化趋势,ST2825抑制MyD88同源二聚化反应并不能完全阻断CP-PGN引起的细胞因子mRNA水平升高,表明CP-PGN并不是通过竞争结合的作用抑制MyD88而进行免疫调节。6.Western blot结果显示CP-PGN作用于细胞系RAW264.7并未引起TRIF蛋白水平发生变化,说明CP-PGN抗MRSA感染免疫调节机制中并不涉及到TLR-非MyD88依赖途径。7.干扰RNA降低细胞系RAW264.7中MyD88基础表达水平,IL-6的分泌水平也发生降低。CP-PGN的进一步作用未引起MyD88蛋白水平发生明显变化,说明MyD88的基础表达水平能够直接影响到CP-PGN对其的调节作用。结论:在CP-PGN作用于MRSA感染前的预防感染过程中,CP-PGN与TLR2结合,能够抑制后续MRSA感染引起的MyD88过度升高,避免感染引起的过度炎症反应。在CP-PGN作用于MRSA感染后的治疗感染过程中,CP-PGN与TLR2结合,能够逆转MRSA感染引起的MyD88过度升高,抑制感染引起的过度炎症反应。初步证实,CP-PGN通过调节MyD88的表达水平使机体保持适度的免疫活化状态,发挥抗感染作用。并且这种CP-PGN对MyD88的适度调节与接触时MyD88的基础表达水平密切相关,其抑制作用并不是通过与MyD88的直接竞争结合引起的,但具体的作用方式和机制还需要更深入的研究证实。本研究发现CP-PGN的抗感染作用与MyD88介导的适度炎症反应密切相关。