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目的:恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)起源于神经嵴黑色素细胞,其恶性程度高,易转移,预后不佳。近些年来,我国恶性黑色素瘤的发病率迅猛增长,已成为皮肤癌死亡的首要原因。目前治疗黑色素瘤最主要的方法是手术切除,但黑色素瘤起病比较隐匿,多数患者就诊时已发生转移,错过了手术治疗的最佳时机。迄今为止,恶性黑色素瘤标准化疗效果欠佳,包括手术在内的多种治疗方法仍未取得突破性进展,因此寻求高效低毒的黑色素瘤治疗药物是目前急需解决的重要问题。近年来,抗生素作为常见药,因其高效、低毒、价廉,已成为癌症治疗的新视点。有研究表明,四环素类抗生素及其衍生物具有抗肿瘤的生物活性。替加环素是第一个被FDA批准的第三代甘氨酰环素类抗生素,其结构与四环素类药物相似,是继多西环素、米诺环素后开发的新一代抗生素。作为四环素类似物的替加环素,现已被用于肿瘤的辅助治疗,如急性白血病、前列腺癌及其他肿瘤术后的治疗。近年,已有研究表明替加环素在恶性血液肿瘤、神经胶质瘤及胃癌中具有明显抑制肿瘤细胞增殖的作用,但是对黑色素瘤的效应及其作用机制尚无报道。本课题以黑色素瘤为主要研究对象,通过体内及体外多种实验手段探讨替加环素抑制黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭及诱导细胞周期阻滞的效应及其具体的分子作用机理,为替加环素作为治疗恶性黑色素瘤的临床候选药物提供更多的理论依据。方法:1采用细胞计数法、MTT(四甲基偶氮唑蓝)比色法检测不同浓度的替加环素(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)对人黑色素瘤细胞增殖的影响,同时应用Brd U免疫荧光对替加环素抑制A375和MV3细胞增殖情况进行分析。2应用PI单染流式细胞分析检测替加环素对细胞周期的影响;不同浓度的替加环素(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)处理后,应用Western blot检测周期相关蛋白的表达,探讨替加环素诱导细胞周期阻滞的机制。3应用24h、48h、72h三个时间点的划痕实验和Transwell小室实验检测替加环素对人A375和MV3黑色素瘤细胞迁移侵袭能力的影响;不同浓度的替加环素(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)处理后,应用Western blot检测迁移侵袭相关的EMT(上皮-间充质转化)蛋白的表达,探讨替加环素抑制细胞转移的机制。4软琼脂克隆形成分析和小鼠体内成瘤实验验证替加环素对人A375和MV3黑色素瘤细胞成瘤性的影响。5应用慢病毒系统以慢病毒为载体上调p21的表达后应用替加环素,检测其对人A375和MV3恶性黑色素瘤细胞增殖、周期、转移和成瘤恢复性的影响。结果:1细胞计数和MTT结果均显示:替加环素能抑制A375和MV3的细胞增殖,并呈现明显的浓度(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)依赖效应关系,且药物浓度越大其抑制作用越显著,差异具有统计学意义(P<0.05);Brd U免疫荧光染色进一步证实,与对照组相比,替加环素处理组Brd U阳性细胞百分比显著降低(P<0.05)。2 PI单染流式细胞分析显示:与对照组相比,替加环素处理组细胞周期G0/G1期比例显著增加(P<0.05)。Western blot检测相关周期蛋白显示:与对照组相比,替加环素处理组的细胞周期蛋白CDK2和Cyclin E的表达量有所下调;细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(CDKN1A,p21CIP1/Waf1)的表达量也明显下调,并呈现明显的浓度(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)和时间(0h、24h、48h、72h)依赖效应关系。3划痕实验和Transwell小室实验均显示:与对照组相比,替加环素处理组显著抑制A375和MV3的迁移和侵袭,并呈现明显的时间(24h、48h、72h)依赖效应关系(P<0.05);Western blot检测相关迁移侵袭的EMT(上皮-间充质转化)蛋白显示:替加环素处理组的EMT蛋白E-Cadherin的表达量有所上调,EMT蛋白Vimentin的表达量有所下调,并呈现明显的浓度(0μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)和时间(0h、24h、48h、72h)依赖效应关系。4软琼脂克隆形成实验显示:与对照组相比,替加环素处理组克隆形成数显著降低(P<0.05);黑色素瘤细胞体内异种移植NOD/SCID小鼠模型的研究结果显示替加环素治疗组的肿瘤体积和平均瘤重显著低于对照组(P<0.05)。5应用慢病毒系统以慢病毒为载体上调p21的表达后显示:与对照组(单一应用DMSO或替加环素)相比,处理组(过表达p21后应用替加环素)恢复了替加环素对A375和MV3恶性黑色素瘤细胞增殖、周期、转移和成瘤的抑制作用。结论:1本实验通过体内外研究证明替加环素通过诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,从而显著抑制黑色素瘤细胞增殖;而且通过抑制上皮-间充质转化(EMT)过程,抑制黑色素瘤细胞迁移和侵袭;同时还明显抑制黑色素瘤细胞克隆形成及小鼠体内成瘤。因此替加环素可以作为治疗黑色素瘤的一种有潜力的候选药物。2 p21在黑色素瘤中具有促进肿瘤细胞增殖的作用。替加环素能下调p21的表达,过表达p21后应用替加环素,可以恢复单独应用药物引起的细胞增殖和转移的抑制作用。因此替加环素对黑色素瘤细胞的抑制作用依赖于p21,p21有望可以作为治疗黑色素瘤的关键靶基因。