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原始卵泡是卵泡发育的起始,其数量的多少也是母鸡产蛋量多少的重要前提之一。对原始卵泡的研究,有助于从源头上增加产蛋母鸡卵泡的数量,从而可以增加母鸡用于产蛋的卵泡库。目前对原始卵泡形成的研究主要集中在哺乳动物上,而在鸟类上的研究较少。因此本实验以海兰雏鸡为研究材料,主要的研究内容有如下两个方面:①探索出壳后一个月内小母鸡卵泡发育的动态变化规律;②明确Notch信号相关基因在卵泡形成前后的变化,并进一步探究Notch信号在原始卵泡形成过程中的作用。 1.卵泡发育动态规律的观察 本研究以出壳后一个月内海兰小母鸡为研究对象,旨在探究卵泡在这一时期的动态变化规律。通过HE染色等方法对出壳后一个月内小母鸡卵巢的形态学分析。结果显示,原始卵泡形成开始于H4,初级卵泡第一次出现在H7,次级卵泡应在H21左右形成。通过卵泡的数量统计发现,在出壳后一个月内,与仍然在生殖细胞簇中的卵母细胞相比,形成卵泡的卵母细胞仅占少数。原始卵泡的数量在H14左右呈下降趋势,在H21又恢复至H7的水平。初级卵泡的数量在H14有明显的上升趋势,在H21的变化不明显,在H28呈下降趋势。次级卵泡在H21有少量的形成,在H28形成加快。但是在这段时间内,单位面积(100×100μm2)内生殖细胞簇的数量并无明显下降趋势。对单个生殖细胞簇中生殖细胞计数发现,生殖细胞簇含有的生殖细胞大多数在17个以下。通过RT-PCR发现,早期减数分裂相关的基因——Stra8、Dmc1、Spo11、Scp3在出壳后一个月内和八月龄的母鸡卵巢中均有表达。这说明出壳后的母鸡中仍有进行减数分裂的可能。综上所述,随着母鸡的发育,除原始卵泡外,各级卵泡在形成后一周左右有加速发育的趋势,而同时原始卵泡和初级卵泡的数量会因为下一级卵泡的形成和发育而出现一定的下降趋势,但之后不久就会恢复起初的水平。在这一时间段内,无论是生殖细胞簇的数量,还是生殖细胞簇中的卵母细胞的百分比均没有明显的变化。单个生殖细胞簇中的生殖细胞的数量也无明显变化。 2.Notch信号在原始卵泡形成中的作用 雌性动物在出生前后或出壳后,其卵巢中会出现一个重要事件——生殖细胞簇的破裂和原始卵泡的形成。之前的研究发现有许多的因子参与这一过程。Notch信号是其中作用非常明显的一种。本研究以雏鸡为研究模型,通过对其卵巢体外培养等方法,探究Notch信号在原始卵泡形成和发育过程中的作用。结果显示,Notch信号在原始卵泡形成前后表达变化明显。Jag2的表达量在所选的时间段内均呈上升趋势(相对于H0),其余受体、配体和靶基因随着发育阶段的不同而呈现不同的变化。在卵巢体外培养体系中加入DAPT(Notch抑制剂)后,通过形态学分析发现,卵泡的数量明显减少,生殖细胞簇的数量明显增多。进一步利用RT-PCR和Western Blot分析发现,PI3K/Akt信号通路的相关基因和蛋白亦受到减弱的Notch信号的抑制,但Pten的表达呈显著上升。与Notch信号相关的E-cadherin和N-cadherin的表达都随着Notch信号的减弱而呈显著的下降。Notch信号的直接下游基因之一c-myc的表达也因Notch信号的抑制而下调。此外,当Notch信号被抑制后,还会下调一些如卵泡形成有关的转录因子的表达,如Ahr、Nobox等。综上所述,Notch信号可能是通过调节PI3K/Akt信号通路的活性、钙黏蛋白的表达以及一些转录因子的表达来影响鸡原始卵泡的形成。 本研究一方面探索了卵泡发育的动态规律,并发现生殖细胞簇在出壳后一个月内变化不明显的现象。另一方面研究了Notch信号相关基因在卵巢中表达变化规律,并证实了Notch信号在生殖细胞簇破裂和原始卵泡形成这一重要生理过程中的作用。这些结果为家禽早期卵泡发育的进一步研究和提升家禽的繁殖性能提供了理论上的依据。