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酪氨酸酶(Tyrosinase, EC.1.14.18.1)又称多酚氧化酶(PPO),广泛存在于微生物、动、植物和人体,它具有单酚酶活性和二酚酶活性,能将酪氨酸羟化,产生邻位二羟基苯丙氨酸(L-多巴),然后再将多巴氧化成多巴醌,进而生成一系列引起褐化的色素类物质,酪氨酸酶是生物体内黑色素合成的关键酶。目前,治疗人体色素障碍性(或沉着性)皮肤疾病的主攻方向之一,是激活(或抑制)酪氨酸酶活性药物的研发。二甲基亚砜常作为这些药物的助溶剂和皮肤渗透剂,用以增加药效。但酪氨酸酶在不同浓度二甲基亚砜溶液中的活性和构象如何发生变化目前并不十分清楚。本论文以市售蘑菇为实验材料,提取酪氨酸酶并对其进行分离、纯化以及对酶反应的最适pH值和温度的测定,并以3,4-二羟基苯丙氨酸(又名:左旋多巴,简写:L-DOPA )为底物,研究了在各种体积分数的二甲基亚砜溶液中酪氨酸酶的酶活性、酶动力学变化。1、确定酶活测定体系为:20 mmol/L pH 7.0磷酸缓冲液,10 mmol/L L-DOPA。经过破碎、硫酸铵分级沉淀、SuperdexTM200凝胶过滤、DEAE-纤维素阴离子交换色谱分离纯化后,电泳得到了单一的蛋白质条带,即证明分离纯化的酪氨酸酶已达电泳纯。此酶最适pH值为6.8,最适温度为30℃,分子量为63.93 KDa。以L-DOPA为底物时,蘑菇酪氨酸酶的比活力为191.03 U/mg,纯化倍数为24.68,回收率为4.9%。2、二甲基亚砜浓度对酪氨酸酶二酚酶活力的影响为:酪氨酸酶催化L-DOPA氧化不存在迟滞过程,在反应体系中加入二甲基亚砜后,其直线的斜率随着加入的二甲基亚砜浓度增大而呈现先上升后下降的趋势,表明二甲基亚砜对酪氨酸酶二酚酶活力在25%体积比浓度下具有激活作用,当二甲基亚砜浓度升高到25%后,酪氨酸酶二酚酶的相对活力下降,表明浓度高于25%后,二甲基亚砜对酪氨酸酶二酚酶具有抑制作用。3、低浓度二甲基亚砜对酪氨酸酶二酚酶激活动力学:低浓度二甲基亚砜对酶的作用机理,实验在测活体系中,固定酶的浓度,改变底物左旋多巴(L-DOPA)浓度,测定不同二甲基亚砜浓度下的反应初始速率(V0)。Lineweaver-Burk双倒数作图为一组平行直线,横轴的截距在低浓度下,随着DMSO浓度的增大而增大。本文章主要探讨了二甲基亚砜对酪氨酸酶二酚酶活性可能的作用机制,在30℃、pH6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系中,采用酶动力学方法研究了二甲基亚砜对酪氨酸酶二酚酶活力的作用。为酪氨酸酶异常表达产生的疾病的药物研发提供实验依据。