杀菌先导化合物HAINU-18和Antidesmone对香蕉炭疽菌的初步作用机制研究

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原创性靶标的发现是绿色农药创制的挑战性课题。本课题组前期研究发现脱氢姜酮衍生物HAINU-18和蛇婆子中提取分离的天然产物Antidesmone具有广谱的杀真菌活性。基于两者结构新颖和对香蕉炭疽菌(Colletotrchum musae)均表现出较好的抑制活性,本论文以香蕉炭疽菌为靶标菌,对两种化合物的初步作用机理展开探索,为寻找两种化合物对真菌的作用靶标奠定基础,论文主要研究内容如下:(1)化合物HAINU-18和Antidesmone对香蕉炭疽菌菌丝生长与孢子萌发的影响。测试结果表明两种化合物对靶标菌菌丝生长(EC50分别为5.53 μg/mL和14.62μg/mL)和孢子萌发(EC50分别为6.37 μg/mL和0.13 μg/mL)均有抑制作用,其中Antidesmone对香蕉炭疽菌孢子萌发的抑制尤为明显。(2)化合物HAINU-18和Antidesmone对香蕉炭疽菌细胞结构和生理生化指标的影响。通过透射电镜超微形态观察发现,经两种化合物处理后靶标菌均出现细胞壁变厚、明显质壁分离和细胞器囊泡化解体现象;不同的是,经Antidesmone处理的靶标菌细胞质密度增加,最终细胞组织崩解。生理生化测试表明,经化合物HAINU-18(6 μg/mL)处理后,菌丝中可溶性蛋白、还原糖、几丁糖含量及几丁质酶活变化均在10%~20%左右,没有显著影响;电导率实验结果显示靶标菌细胞膜相对渗透率提高了 90.03%,可见化合物HAINU-18明显破坏了靶标菌的细胞膜结构。经Antidesmone(15 μg/mL)处理后,菌丝中可溶性蛋白、还原糖、几丁糖含量及几丁质酶活变化均在5%~30%左右,细胞膜相对渗透率提高了 72.81%,可见Antidesmone也明显破坏了靶标菌的细胞膜结构。由于化合物HAINU-18和Antidesmone对靶标菌细胞膜均有破坏,进一步测定了两种化合物对细胞膜麦角甾醇含量的影响,结果显示靶标菌经化合物HAINU-18处理后,麦角甾醇含量降低了 72.31%,继而通过GC-SIM-MS对麦角甾醇合成相关联物质羊毛甾醇及角鲨烯含量进行检测,结果显示化合物HAINU-18对羊毛甾醇及角鲨烯含量的抑制率分别为70.01%和57.10%,同时,Antidesmone对麦角甾醇,羊毛甾醇及角鲨烯的抑制率分别为 45.64%、78.95%和73.19%,可见化合物 HAINU-18 和 Antidesmone对细胞膜麦角甾醇生物合成有明显抑制作用。(3)化合物HAINU-18和Antidesmone对香蕉炭疽菌细胞呼吸及能量代谢的影响。结果表明,随着药剂处理时间的增加,两种化合物对靶标菌呼吸作用具有明显的抑制作用,抑制活性高于嘧菌酯,同时,靶标菌丙酮酸含量呈现不同的变化,但对三羧酸循环关键酶活性无显著影响。(4)化合物HAINU-18和Antidesmone对香蕉炭疽菌氧化应激及细胞凋亡的诱导作用。结果显示化合物 HAINU-18(6 μg/mL)和 Antidesmone(15 μg/mL)处理后均一定程度上导致活性氧(ROS)迸发,线粒体膜电位受损,DNA损伤。(5)化合物HAINU-18对香蕉炭疽菌转录组的影响。采用高通量测序技术对实验组(经HAINU-18处理的香蕉炭疽菌)和对照组(未经HAINU-18处理的香蕉炭疽菌)处理的香蕉炭疽菌进行转录组测序。通过GO分析发现,以对照组为参考数据,处理组有3376个基因上调,1984个基因下调,处理组和对照组共有5360个差异基因可以被富集于条代谢通路中,有14个信号通路被显著富集,其中包括脂质的生物合成与代谢相关、过氧化物酶活性、甾醇类生物合成、丙酮酸代谢催化活性及抗氧化活性的信号通路等。以上实验从细胞结构和超微形态、生物合成、生物氧化、细胞能量代谢及细胞凋亡五个方面分别探究化合物HAINU-18和Antidesmone对香蕉炭疽菌的抑菌机理。研究结果表明,化合物HAINU-18对香蕉炭疽菌的细胞膜麦角甾醇及羊毛甾醇含量影响最为明显,也影响了靶标菌能量代谢过程,导致细胞凋亡,从而达到抑菌效果。Antidesmone则是影响了角鲨烯生物合成过程和靶标菌能量代谢过程,引起靶标菌活性氧(ROS)积累,线粒体膜电位降低,DNA受损,从而导致细胞凋亡达到其抑菌效果。
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