p53突变是肿瘤组织最常见的突变。大多数p53突变蛋白获得了促进肿瘤进程的功能,因此突变体p53已成为肿瘤靶向治疗的关注焦点。我们的前期研究发现,在衰老模型细胞系形成的肿瘤中,都存在同一个p53突变——p53S(p53N236S,人类为p53N239S)。p53S蛋白丧失了DNA结合和调控下游基因的能力,可与Ras协同致癌,且p53S基因敲入的小鼠会在早期发生高恶性肿瘤,表明p53S蛋白获得了致癌新功能,可能成为肿瘤治疗的关键靶点。由于p53S与衰老诱导的肿瘤发生直接相关,因此对其突变特性的研究有助于我们了解衰老与肿瘤发生的相关性。同时,肿瘤分子流行病学研究表明,在乳腺癌、膀胱癌、大肠癌、胃癌、脑瘤等肿瘤病例中均发现了p53S突变,表明这种突变蛋白在肿瘤发生中的重要性,因而可能成为肿瘤治疗的重要靶点之一。因此,本研究的第一部分拟获得纯化的p53S蛋白,为后期的p53S晶体制备奠定基础。我们利用定点突变技术,构建pGEX-4T-1-p53S原核表达质粒,之后转化大肠杆菌BL21 (DE3),通过IPTG诱导GST-p53S融合蛋白的过表达,之后利用GST标签,通过亲和层析获得纯的GST-p53S融合蛋白,最后利用凝血酶切除GST标签,通过疏水层析技术除去凝血酶和其他杂蛋白,获得纯化的p53S蛋白。我们发现,p53S蛋白在常温下并不稳定。随着时间的延长,p53S蛋白逐渐降解。另外,p53S蛋白对pH较为敏感。在pH=6.3的时候较为稳定,高pH和低pH下,p53S蛋白解离、降解速度加快。GST-p53S融合蛋白的稳定性较p53S蛋白的稳定性要好,但是随着时间的延长,GST-p53S蛋白也会降解。由于本实验中的p53S蛋白是在原核系统中获得的,因此,最终获得的p53S蛋白的结构与人的p53S蛋白结构可能有一定的差异。但是,这些结果会给将来的小分子药物研发、分子模拟等方面提供一些数据支持。本研究另一部分则着手于癌基因KrasG12D与p53N236S在小鼠模型中的相互作用研究。原癌基因Ras突变会使抑癌基因p53应激,引发下游一系列衰老、凋亡反应。但是,当p53被抑制或者发生突变时,p53失去了对Ras的正常监控,导致细胞过度增殖,进而引发肿瘤。某些p53突变甚至获得了癌基因潜能,这些突变的p53与Ras突变共同作用更易发生肿瘤,且恶性程度也更高。我们发现,在细胞水平中,p53S可与过表达的Ras协同导致肿瘤发生。将p53-/-+p53S+HrasG12V的MEF细胞注射给SCID小鼠,小鼠会罹患肿瘤,表明HrasG12V增强了p53S蛋白的致癌功能。由于上述结果是在外源性的HrasG12V过表达的条件下得到的,故不能完全反映内源性的原癌基因Ras与p53S的相互作用。因此,我们拟获得KrasG12D/+p53S的小鼠,从小鼠水平观测KrasG12D与p53S的相互作用。本研究中,我们使用三种基因工程小鼠——Cre小鼠(可由他莫昔芬诱导表达Cre重组酶蛋白)、KrasG12D/+小鼠(KrasG12D基因前带有可被Cre重组酶蛋白切除的LSL停止表达元件)、p53S小鼠进行杂交,获得Cre KrasG12D/+p53S的杂交小鼠。拟在Cre KrasG12D/+p53S小鼠出生4-6周时注射他莫昔芬,连续注射他莫昔芬1周。注射结束后6-8周,取小鼠的肺组织进行HE染色和IHC,分析小鼠的病理情况。对小鼠的所有组织进行取样,通过蛋白质免疫印迹(WB)分析小鼠各组织中KrasG12D和p53S的表达量。我们发现,杂交产生的Cre KrasG12D/+p53S小鼠的出生率非常低,且出生的Cre KrasG12D/+p53S小鼠的体型较正常小鼠小。4周龄时检测其LSL,发现并未发生切除。然而,该基因的小鼠在并未注射他莫昔芬的情况下,在8周龄肺部发生肿瘤。取其肺部组织进行LSL检测,发现肺部组织的LSL已经发生了切除,证明KrasG12D发生了激活。IHC和WB的结果也均证实了KrasG12D的激活。究竟是何种机制激活了KrasG12D,目前尚不清楚。本研究仅仅发现了在小鼠水平,KrasG12D的异常激活使小鼠罹患了肿瘤,但是其分子机制暂不清楚。在细胞水平,对KrasG12D和p53S的相互作用的探索也刚刚起步,后续还需要对详细的分子机制进行探究。