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研究背景人腺病毒3型（HAd V-3）和7型（HAd V-7）是引起全球5岁以下儿童下呼吸道感染的主要腺病毒血清型。流行病学报告表明,HAd V-7感染与重症感染密切相关。HAd V-7重症感染可并发心肌炎,中枢神经系统功能障碍等。少量尸检结果报道了腺病毒重症感染的组织病理和病毒分布,提示HAd V-7有感染多器官的可能性。但是关于HAd V-7对各器官影响的研究十分有限。因此,分析HAd V-7感染多器官的可能性,有助于进一步理解HAd V-7更易造成重症感染的机制。研究表明HAd V-7感染患者存在病毒血症。肺泡上皮细胞及其邻近的肺微血管内皮细胞形成的肺泡-毛细血管屏障,阻止了HAd V-7在人体内的传播。因此,HAd V-7可能通过某种途径穿越肺泡-毛细血管屏障,进入外周循环系统,引起病毒血症。肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞具有极性,HAd V-7感染极化细胞过程中,病毒感染和释放的方向性和屏障完整性可能是影响病毒血症发生的关键。研究目的1、通过HAd V-7和HAd V-3感染来源于人不同器官的细胞系的敏感性,分析HAd V-7感染多器官的可能性,进一步探究HAd V-7更易造成重症感染的机制。2、使用肺泡上皮细胞,肺微血管内皮细胞和肺泡上皮-内皮共培养模型,模拟体内肺泡-毛细血管屏障,探究病毒血症发生机制。研究方法1、分别使用5TCID50/cell的HAd V-3和HAd V-7感染Hep-2,Calu-3,HFL-1,Caco-2,Huh-7,CCC-HEH-2,HEK-293,Hela,RD,THP-1,U937和Raji,测定并比较HAd V-7和HAd V-3感染后不同时间点上清的病毒滴度;间接免疫荧光法检测并比较HAd V-7和HAd V-3感染后HAd V Hexon蛋白的表达。使用流式细胞术检测并比较腺病毒受体CD46和DSG-2在上述细胞中的表达情况。2、肺泡上皮细胞（NCI-H441）和肺微血管内皮细胞（HPMEC）接种transwell小室,构建极化肺泡上皮细胞,肺微血管内皮细胞和肺泡上皮-内皮细胞共培养模型,模拟体内肺泡-毛细血管屏障,探究病毒血症发生的可能机制。当肺泡上皮细胞TEER达到500 Ohm·cm~2以上,肺微血管内皮细胞TEER达到20 Ohm·cm~2以上,共培养模型TEER达到1000 Ohm·cm~2以上时,用于后续实验。3、分别使用10TCID50/cell的HAd V-3和HAd V-7通过顶端和基底端感染NCI-H441、HPMEC和共培养模型,每天测定TEER,评估细胞模型的完整性。间接免疫荧光检测HAd V Hexon蛋白表达,分析病毒的感染途径。测定不同时间点的上室和下室中病毒滴度,分析病毒通过顶端和基底端感染细胞后病毒的释放途径。采用Western Blot法检测闭合蛋白（occludin）,粘附链接分子A（JAM-A）,密封蛋白4（claudin-4）和β-连环蛋白（β-catenin）的表达情况,分析病毒感染肺泡-毛细血管屏障后上皮细胞间紧密连接蛋白的变化。4、采用Graphpad Prism 6.01软件进行统计分析,变量结果采用均数±标准差（（?）±SD）表示,多个组（≥3）间比较差异采用单因素方差分析,两个组间比较差异采用独立样本t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果1、在感染第3和5天,Hep-2,Calu-3,Caco-2,Huh-7,CCC-HEH-2,HEK-293,Hela,HFL-1,THP-1和RD细胞检测到HAd V Hexon蛋白表达,表明HAd V-7和HAd V-3可以感染这些细胞。Raji和U937未检测到HAd V Hexon蛋白表达。2、第5天,HAd V-7感染CCC-HEH-2的滴度(1×103.79±0.156TCID50/ml)高于HAd V-3(1×103.167±0.059TCID50/ml)（P＜0.05）,HAd V-7感染HEK-293的滴度(1×104.278±0.020TCID50/ml)高于HAd V-3(1×103.861±0.104TCID50/ml)（P＜0.05）,HAd V-7感染Hep-2的滴度(1×105.070±0.052TCID50/ml)高于HAd V-3(1×104.722±0.119TCID50/ml)（P＜0.05）,HAd V-7感染Calu-3的滴度(1×104.833±0.059TCID50/ml)高于HAd V-3(1×104.292±0.257TCID50/ml)（P＜0.05）,HAd V-7感染HFL-1的滴度(1×102.981±0.126TCID50/ml)高于HAd V-3(1×102.583±0.059TCID50/ml)（P＜0.05）,HAd V-7感染Caco-2的滴度(1×102.667±0.059TCID50/ml)高于HAd V-3(1×102.375±0.102TCID50/ml)（P＜0.05）,HAd V-7感染Huh-7的清滴度(1×103.042±0.059TCID50/ml)高于HAd V-3(1×102.500±0.177TCID50/ml)（P＜0.05）,HAd V-7感染Hela的滴度(1×104.792±0.156TCID50/ml)与HAd V-3(1×104.500±0.102TCID50/ml)无显著差异（P＞0.05）,HAd V-7感染THP-1的滴度(1×103.750±0.177TCID50/ml)与HAd V-3(1×104.083±0.059TCID50/ml)无显著差异（P＞0.05）。3、腺病毒受体DSG-2在Hep-2,Hela,Calu-3,HEK-293高水平表达,与A549细胞无显著差异。DSG-2在CCC-HEH-2,Hu H-7和Caco-2上中等水平表达,在Raji,THP-1,U937和RD上低水平表达,均明显低于A549。这些细胞中超过85%的细胞表达CD46,与A549无显著差异。提示腺病毒受体DSG-2的表达水平与病毒感染有关。4、HAd V-7和HAd V-3通过顶端或基底端感染NCI-H441和HPMEC,均检测到HAd V Hexon蛋白表达,提示病毒可以通过顶端或基底端感染肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞。HAd V-7感染NCI-H441,HPMEC和共培养模型后TEER均明显低于HAd V-3,表明HAd V-7感染引起更严重的肺泡-毛细血管屏障损伤。5、与对照组相比,HAd V-7通过顶端感染肺泡上皮细胞（NCI-H441）后第1天(1×102.375±0.177TCID50/ml),第2天(1×104.083±0.059TCID50/ml)和第3天(1×104.375±0.102TCID50/ml)的顶端病毒滴度增高（P＜0.05）;HAd V-7基底端感染NCI-H441第2天(1×101.917±0.156TCID50/ml)和第3天(1×102.625±0.368TCID50/ml)顶端病毒滴度增高（P＜0.05）;HAd V-7顶端或基底端感染NCI-H441第1,2和3天基底端病毒滴度无显著差异。与HAd V-7感染类似,HAd V-3顶端或基底端感染NCI-H441后顶端病毒滴度增加。表明HAd V-7和HAd V-3顶端或基底端感染肺泡上皮细胞,新形成的病毒主要从细胞顶端释放。HAd V-7顶端感染NCI-H441第3天顶端病毒滴度高于HAd V-3（P＜0.05）,表明HAd V-7在肺泡上皮细胞的复制能力高于HAd V-3。6、与对照组相比,HAd V-7通过顶端感染肺微血管内皮细胞（HPMEC）后第1天(1×102.292±0.118TCID50/ml),第2天(1×102.917±0.156TCID50/ml)和第3天(1×103.083±0.257TCID50/ml)顶端病毒滴度增高（P＜0.05）;HAd V-7顶端感染HPMEC第3天(1×101.917±0.059TCID50/ml)基底端病毒滴度增高（P＜0.05）;HAd V-7通过基底端感染HPMEC第2天(1×102.542±0.156TCID50/ml)和第3天(1×102.500±0.177TCID50/ml)顶端病毒滴度增高（P＜0.05）。HAd V-7基底端感染HPMEC第1天(1×102.250±0.102TCID50/ml),2天(1×102.667±0.236TCID50/ml)和3天(1×102.792±0.236TCID50/ml)基底端病毒滴度增高（P＜0.05）。与HAd V-7感染类似,HAd V-3顶端或基底端感染HPMEC,顶端或基底端病毒滴度增加。表明HAd V-7和HAd V-3顶端或基底端感染肺微血管内皮细胞,新形成的病毒会从细胞的顶端和基底端释放。HAd V-7顶端感染后第2天基底端病毒滴度高于HAd V-3（P＜0.05）,HAd V-7基底端感染后第2,3天顶端和基底端病毒滴度高于HAd V-3（P＜0.05）。结果表明HAd V-7感染HPMEC后病毒复制能力显著高于HAd V-3。7、与对照组相比,HAd V-7通过顶端感染肺泡上皮-内皮细胞共培养模型后第2天(1×102.450±0.389TCID50/ml)和3天(1×104.000±0.102TCID50/ml)transwell上室病毒滴度增高（P＜0.05）;HAd V-7顶端感染共培养模型后第1,2,3天基底端病毒滴度无显著差异。与HAd V-7感染类似,HAd V-3顶端感染共培养模型后,transwell上室的病毒滴度增加。结果提示病毒感染肺泡上皮-内皮细胞屏障后,新形成的病毒主要从上皮细胞顶端释放。HAd V-7感染共培养模型第3天病毒滴度高于HAd V-3（P＜0.05）,表明HAd V-7在肺泡-毛细血管屏障的复制能力高于HAd V-3。8、与感染前相比,HAd V-7和HAd V-3感染后claudin 4、JAM-A、occludin蛋白的表达量呈下降趋势,表明HAd V-7和HAd V-3感染肺泡-毛细血管屏障后上皮细胞间紧密连接受损。研究结论1、HAd V-7和HAd V-3存在感染多器官的可能性,HAd V-7的高效复制可能是HAd V-7易引起重症感染的机制。2、HAd V-7和HAd V-3破坏上皮细胞间紧密连接,有利于病毒穿过肺泡上皮细胞,接触并感染血管内皮细胞,可能是引起病毒血症的机制。HAd V-7感染肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞的复制能力高于HAd V-3,并且引起屏障完整性更严重的损伤,这可能是相较于HAd V-3,HAd V-7感染更易引起病毒血症的原因。