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目的:原发性肝癌(Hepatocelluar Carcinoma,HCC)起病隐匿,很多病人发现肿瘤时已经处于晚期,失去了手术治疗的机会,而射频消融(Radiofrequency Ablation,RFA)已经成为是治疗肝脏肿瘤的重要手段,具有微创,相对安全,疗效确切等优点,是不适合外科切除或肝移植的早期原发性肝癌的首选治疗方法。然而,相比于外科手术切除,RFA表现出更高的肿瘤复发率。越来越多的研究表明,RFA不仅是一种局部肿瘤治疗手段,还可以激活系统性的抗肿瘤免疫能力,然而,这种特异性的抗肿瘤免疫能力很弱,不足以单独起到杀灭肿瘤的作用。因此如何提高RFA术后特异性的抗肿瘤免疫能力,降低RFA术后的肿瘤复发,成为目前国内外研究的热点。近年来,免疫检查点研究在临床实验中取得了重大突破,这种疗法是通过调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应,从而达到杀灭肿瘤的目的。因此,本研究拟联合免疫检查点抑制剂-CTLA-4阻滞剂和RFA,发挥两者的协同作用,提高RFA术后的系统性的抗肿瘤免疫能力,降低RFA术后的肿瘤复发和转移,延长HCC患者的生存率。材料和方法:1.CTLA-4阻滞剂联合RFA提高系统性的抗肿瘤免疫能力的研究;40只BALB/c雄性小鼠(7-9周)右侧腹壁建立皮下H22肿瘤模型。实验动物随机分为4组:对照组(小鼠不接受任何治疗);RFA组(小鼠仅接受RFA治疗);Anti-CTLA-4组(小鼠仅接受腹腔内Anti-CTLA-4抗体注射);RFA+Anti-CTLA-4组(小鼠先RFA治疗后接受腹腔内Anti-CTLA-4抗体注射)。RFA治疗后6天后行再激发试验,于各组小鼠左侧腹壁再次注射H22肿瘤细胞,观察左侧腹壁肿瘤成瘤情况。每组10只小鼠,8只用于进行肿瘤评估和无肿瘤生存期观察,2只于与RFA后2周处死取脾脏组织,提取其中淋巴细胞,行γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)浓度检测。在实验观察期结束后,对产生肿瘤免疫力的小鼠(左侧腹壁肿瘤直径≤5mm)的肿瘤取材,进行组织病理学检查和肿瘤侵润淋巴细胞分型(Tumor Infiltrating Lymphocytes,TIL)的检测。2.CTLA-4阻滞剂联合RFA抑制未经治疗的远处肿瘤生长及转移的研究:40只BALB/c雄性小鼠(7-9周)左右两侧腹壁均建立皮下H22肿瘤模型。实验动物随机分为4组:对照组(小鼠不接受任何治疗);RFA组(小鼠仅右侧肿瘤RFA治疗);Anti-CTLA-4组(小鼠仅接受腹腔内Anti-CTLA-4抗体注射);RFA+Anti-CTLA-4组(小鼠先右侧肿瘤RFA治疗后再接受腹腔内Anti-CTLA-4抗体注射)。每组10只小鼠,8只用于进行左侧腹壁肿瘤评估和生存观察,2只于RFA后2周处死对左侧未治疗肿瘤行组织病理学分析。3.CTLA-4阻滞剂抑制不完全消融后残存肿瘤的生长及转移的研究:40只BALB/c雄性小鼠(7-9周)右侧腹壁建立皮下H22肿瘤模型。实验动物随机分为4组:对照组(小鼠不接受任何治疗);RFA组(小鼠接受不RFA部分肿瘤消融治疗);Anti-CTLA-4组(小鼠仅接受腹腔内Anti-CTLA-4抗体注射);RFA+Anti-CTLA-4组(小鼠行RFA部分肿瘤消融,后接受腹腔内Anti-CTLA-4抗体注射)。每组10只小鼠,8只用于进行右侧腹壁残存肿瘤评估和生存观察,2只于RFA后2周处死对残留肿瘤行组织病理学分析。结果:1.45只小鼠接受右侧腹部皮下肿瘤种植,其中2只未能皮下成瘤,取40只随机分成四组,每组10只。RFA组,RFA+Anti-CTLA-4组小鼠全部进行RFA操作,无严重并发症发生及动物死亡。RFA+Anti-CTLA-4组有6只(75%)动物观察期结束后左侧肿瘤最大直径小于5mm,其余各组左侧肿瘤直径均大于5mm,且体积均随时间持续增加。RFA+Anti-CTLA-4组的肿瘤生长速度(Special Growth Rate,SGR)为0.12±0.01明显小于其他各组(对照组:0.28±0.11;RFA组:0.18±0.06;Anti-CTLA-4组:0.19±0.02,p均<0.05)。对照组中位无肿瘤生存时间为15天(12-21天),RFA组为15天(12-42天),Anti-CTLA-4组为18天(12-27天),RFA+Anti-CTLA-4组为42天(24-42天)。RFA+Anti-CTLA-4组的无肿瘤生存时间明显长于其他三组(p均<0.05)。IFN-γ浓度检测显示RFA+Anti-CTLA-4组的脾脏淋巴细胞的IFN-γ浓度(1498.28±145.39 pg/ml)显著高于其余三组(对照组539.21±87.81 pg/ml,p=0.000;RFA组698.13±211.35 pg/ml,p=0.000;Anti-CTLA-4组821.12±133.35 pg/ml,p=0.000)。Anti-CTLA-4组和RFA组的IFN-γ浓度比较无统计学差异(p=0.137),但均高于对照组(p=0.000,p=0.04)。观察期结束后,RFA组有2只,RFA+Anti-CTLA-4组有6只小鼠产生了肿瘤免疫力,组织病理学结果显示RFA+Anti-CTLA-4组的小鼠的左侧肿瘤中有大量的CD4+,CD8+肿瘤侵润淋巴细胞。2.45只小鼠接受双侧腹部皮下肿瘤种植,其中3只未能双侧皮下成瘤,取40只随机分成四组,每组10只。RFA组,RFA+Anti-CTLA-4组小鼠全部进行RFA操作,无严重并发症发生及动物死亡。在观察其内,四组动物左侧未治疗的肿瘤均随时间而增大,对照组,RFA组,Anti-CTLA-4组和RFA+Anti-CTLA-4组的SGR分别为0.17±0.03,0.17±0.03,0.15±0.04以及0.10±0.02。RFA+Anti-CTLA-4组的SGR显著小于其他三组(vs.对照组:p=0.003;vs.RFA组:p=0.004;vs.Anti-CTLA-4组:p=0.010)。对照组,RFA组,Anti-CTLA-4组和RFA+Anti-CTLA-4组小鼠的中位生存时间分别为:21.5天(14–28天),20.5天(15–26天),27天(21-39天)和39天(21-39天);无转移中位生存时间分别为:17.5天(12-20天),18.5天(13–23天),26.5天(13-28天)和40天(18-42天),RFA+Anti-CTLA-4组小鼠的生存时间和无转移生存时间均显著长于其他三组(p均<0.05)。组织病理学显示RFA+Anti-CTLA-4组的未治疗肿瘤中有大量CD4+,CD8+淋巴细胞侵润。3.45只小鼠接受右侧腹部皮下肿瘤种植,其中2只未能皮下成瘤,取40只随机分成四组,每组10只。RFA组,RFA+Anti-CTLA-4组小鼠全部进行RFA操作,无严重并发症发生及动物死亡。在RFA+Anti-CTLA-4组,3只小鼠的残余肿瘤为完全缓解(Complete Response,CR),1只小鼠的残余肿瘤为无进展(Stable Disease,SD)。对照组,RFA组,Anti-CTLA-4组和RFA+Anti-CTLA-4组的SGR分别为0.20±0.05,0.22±0.08,0.18±0.05以及0.04±0.10,RFA+Anti-CTLA-4组的SGR显著小于其他各组(vs.对照组:p=0.009;vs.RFA组:p=0.004;vs.Anti-CTLA-4组:p=0.021)。对照组,RFA组,anti-CTLA-4组和RFA+Anti-CTLA-4组小鼠的中位生存时间分别为:21.5天(14-28天),20.5天(15–26天),27天(21-39天)以及39天(21-39天);无转移中位生存时间分别为:17.5天(12-20天),18.5天(13–23天),26.5天(13-28天),40天(18-42天)。RFA+Anti-CTLA-4组小鼠的生存时间和无转移生存时间均显著长于其他三组(p均<0.05)。组织病理学显示RFA+Anti-CTLA-4组的残存肿瘤中有大量CD4+,CD8+淋巴细胞侵润。结论:CTLA-4阻滞剂可以提高RFA后系统性的抗肿瘤免疫能力,对于未治疗的肿瘤以及不充分RFA所引起的残存肿瘤均能起到抑制生长和转移的作用,延长动物生存时间。这种联合治疗肝癌的方法有望提高RFA对原发性肝癌,转移性肝癌患者的治疗效果,降低RFA术后肿瘤的复发率。