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目的观察重症急性胰腺炎(SAP)伴急性肺损伤(ALI)大鼠经清胰汤灌胃治疗后血浆中线粒体DNA(mt DNA)水平和肺组织甲酰肽受体(FPR)活化以及炎症损伤改变情况,探讨清胰汤通过调控损伤相关分子模式(DAMPs)对重症急性胰腺炎伴发急性肺损伤(SAP-ALI)大鼠的保护作用机制;通过微生物16Sr DNA测序技术检测大鼠粪便中微生物菌群改变,初步探讨清胰汤对重症急性胰腺炎大鼠肠道微生态的调整作用。方法1.清胰汤调控DAMPs对SAP-ALI大鼠肺组织器官损伤治疗机制的研究将30只SPF级健康雄性Wistar大鼠按照随机数字法分为对照组、模型组、清胰汤组各10只。清胰汤组在实验前一周给予清胰汤10m L/kg灌胃,其余两组给予等量的生理盐水。清胰汤组与模型组在大鼠胆胰管内逆行注射牛磺胆酸钠制作模型;对照组仅在开腹后轻轻翻动胰腺,即关闭腹腔。24h后,颈部脱臼法处死大鼠。标本采集取出肺组织,10%福尔马林溶液固定,一部分进行苏木精-伊红(HE)染色以及FPR1的免疫组化(IHC)染色,镜下观察肺组织病理变化,并进行病理损伤评分;一部分匀浆提取组织上清液,ELISA法检测髓过氧化物酶(MPO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)水平;取全血,留取血浆测定淀粉酶(AMY)和脂肪酶(LIP)水平;提取血浆中游离DNA,通过RT-PCR法,检测循环血浆中线粒体DNA(mt DNA)含量;采用Western blotting法检测各组大鼠肺组织中的甲酰肽受体1(FPR1)、甲酰肽受体2(FPR2)蛋白含量,同时采用RT-PCR法在基因水平检测FPR1、FPR2m RNA含量。2.运用16Sr DNA测序技术初步探讨清胰汤调整SAP大鼠肠道微生态菌群结构的研究30只SPF级健康雄性Wistar大鼠,分组以及建模方法同上,标本收集各组中结肠和胰腺组织,采用苏木精-伊红(HE)染色法观察结肠和胰腺组织病理变化,同时收集大鼠盲肠段粪便,16Sr DNA测序技术分析各组大鼠肠道微生物菌群的变化。结果1.清胰汤调控DAMPs对SAP-ALI大鼠肺组织器官损伤治疗机制的研究1.1肺组织HE染色比较:与对照组相比,模型组肺组织有明显肺血肿、肺淤血表现,大部分肺泡间隔明显增宽,肺泡腔部分融合成肺大泡,肺泡中大量PMN、巨噬细胞浸润(P<0.01),而清胰汤组炎症反应明显减轻(P<0.05)。1.2肺组织中MPO、TNFα、IL-1及IL-6水平测定:较对照组相比,模型组中MPO、TNFα、IL-1及IL-6水平显著升高(P<0.01),但是清胰汤治疗组显著降低这些指标(P<0.01)。1.3血浆AMY和LIP测定:较对照组相比,模型组中AMY和LIP水平显著升高(P<0.01),但是清胰汤治疗组显著降低这些指标(P<0.01)。1.4血浆mt DNA的荧光定量PCR检测:较对照组相比,模型组中大鼠循环血中mt DNA水平显著升高(P<0.01),但是清胰汤组可显著下调血浆中mt DNA含量(P<0.01)。1.5肺组织中FPR1 IHC染色比较:通过各组光密度值可知,与对照组相比,模型组大鼠肺组织中可见明显的肺泡水肿,大量的中性粒细胞浸润等病理表现(P<0.001);而清胰汤组炎细胞浸润、肺泡水肿程度较模型组降低(P<0.05)。1.6肺组织中FPR1、FPR2 m RNA及蛋白表达比较:模型组肺组织中FPR1、FPR2m RNA和蛋白相对表达量高于对照组(P<0.01),清胰汤组肺组织中FPR1、FPR2 m RNA和蛋白相对表达量低于模型组(P<0.01)。2.运用16Sr DNA测序技术初步探讨清胰汤调整SAP大鼠肠道微生态菌群结构的研究2.1各组肠、胰腺组织的病理学评分比较从病理结果中显示,模型组中肠组织表现为肠壁水肿,肠黏膜上皮缺损、脱落等,上皮下间质空隙变宽,大量PMN等炎性细胞浸润等;胰腺组织表现为胰腺腺泡水肿、坏死,小叶间隔增宽,大量PMN等炎性细胞浸润等(P<0.05),而中药清胰汤可减轻模型组中的胰腺损伤和肠黏膜受损程度(P<0.05)。表明本实验的大鼠重症急性胰腺炎造模成功,清胰汤对SAP的胰腺实质损伤以及肠道的黏膜损伤有一定的修复以及保护作用。2.2各组粪便中肠道菌群多样性分析三者之间物种差异性比较具有统计学意义(P<0.05)。测序的样本量足够大,具有一定程度的代表性,基本可以反应出测序的绝大多数菌群物种的生物信息,且所测同组中样本组成的均匀度相似。2.3肠道菌群结构分析:从门、纲、属三个水平分析结果显示清胰汤组可有效降低SAP大鼠厚壁菌门含量,其中包括梭菌纲(优杆菌属)和芽孢杆菌纲(梭状芽孢杆菌属),以及毛螺菌属数量菌群含量下降,升高拟杆菌门(包括拟杆菌纲、拟杆菌属)和乳酸杆菌属含量(均P<0.05)。结论1.SAP大鼠血浆中mt DNA水平升高,而中药清胰汤灌胃可有效降低SAP大鼠循环血中mt DNA水平,起到对机体器官保护作用,且SAP大鼠循环血中mt DNA也许可作为一种判断SAP受损严重程度的指标。2.中药清胰汤灌胃可通过活化SAP-ALI中肺组织各种炎性细胞表面的FPR1和FPR2的表达,起到对SAP-ALI中肺组织过度炎症反应的保护作用。3.中药清胰汤可增加SAP大鼠的肠道菌群的多样性和丰富性,调控微生物生态平衡,增加益生菌群的含量,降低有害菌群的定植能力,从而达到对肠道的保护作用。