背景及目的组织工程技术是目前再生医学中的应用最广泛的技术,通常包含种子细胞、细胞支架和生长因子三要素。在多种类型的种子细胞当中,间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是目前最常用的、拥有巨大发展前景的。间充质干细胞是一种成体多能干细胞,在体外能够进行自我复制更新,并且可以分化为多种细胞和组织。然而,间充质干细胞在临床治疗的实际运用却受到了很多的限制,原因之一是间充质干细胞在研究和应用过程中会逐渐衰老(senescence)。细胞衰老(cellular senescence)是一种细胞逐渐永久地失去增殖力、同时保持存活的细胞过程。目前,细胞衰老的发生、发展机制仍然没有研究的特别清楚。有证据表明,microRNA (miRNA)可能在细胞衰老的过程中扮演了重要的角色。microRNA是一组非编码小RNA,通常的长度为18-25个核苷酸,通过与靶基因的3’UTR区的结合来降解mRNA或阻止翻译,抑制靶基因的表达。我们的前期研究发现,miR-29c-3p在间充质干细胞的复制性衰老(replicative senescence)过程中的表达量逐渐升高,提示miR-29c-3p在调控间充质干细胞衰老过程中的重要作用。本研究目的在于通过功能获得和功能缺失性等实验,重点探讨miR-29c-3p对间充质干细胞衰老的调控作用,预测并验证其靶基因,并探究其调控的细胞通路,以期更细致地阐明间充质干细胞衰老的具体机理,为MSC今后的临床使用打下理论基础。方法对人骨髓来源的间充质干细胞进行长时间传代培养,并利用microRNA的类似物和抑制物对MSC进行转染,过表达和抑制MSC的miR-29c-3p水平,然后对MSC进行衰老相关-β-半乳糖苷酶染色、细胞免疫荧光染色、Edu细胞增殖染色、CCK-8细胞增殖检测、培养上清液ELISA检测、衰老标志基因qPCR检测、Western blot检测、分化能力检测等。利用生物信息学软件和分子生物学方法,预测并验证miR-29c-3p的下游靶基因,并采用小RNA干扰技术抑制MSC内源性表达miR-29c-3p的靶基因,再利用上述方法检测MSC的多种衰老相关表型。结果1.人骨髓来源的间充质干细胞在长期传代培养的过程中,细胞会发生复制性衰老,出现细胞衰老相关的多种表型,如衰老相关-β-半乳糖苷酶染色阳性、衰老相关异染色质聚集、衰老相关分泌表型、衰老标志基因表达变化、分化能力下降等。2.人骨髓来源的间充质干细胞过表达miR-29c-3p后,细胞会出现衰老相关的多种表型,如衰老相关-β-半乳糖苷酶染色阳性、衰老相关异染色质聚集、衰老相关分泌表型、衰老标志基因表达变化、分化能力下降等。3.人骨髓来源的间充质干细胞低表达内源性miR-29c-3p后,细胞衰老的程度有所恢复,如衰老相关-β-半乳糖苷酶染色阳性率下降、衰老相关异染色质聚集减少、衰老相关分泌表型阴性、衰老标志基因表达变化、分化能力恢复等。4.通过生物信息学和分子生物学实验预测并确证miR-29c-3p下游发挥调控作用的靶基因为CNOT6。5.抑制CNOT6在人骨髓来源的间充质干细胞的内源性表达后,细胞会出现衰老相关的多种表型,如衰老相关-β-半乳糖苷酶染色阳性、衰老相关异染色质聚集、衰老相关分泌表型、衰老标志基因表达变化、分化能力下降等。6.免疫蛋白印迹实验表明,p53-p21和p16-pRB两条信号通路中的靶点蛋白在MSC复制性衰老和miR-29c-3p诱导衰老的过程中表达得到增强。结论1.MSC在长期传代培养的过程中,会发生复制性衰老,出现衰老相关的各种表型,如衰老相关-β-半乳糖苷酶染色阳性、衰老相关异染色质聚集、衰老相关分泌表型、衰老标志基因表达变化、分化能力下降等。2.miR-29c-3p可以促进MSC的细胞衰老,使MSC出现衰老相关的各种表型。3.CNOT6为miR-29c-3p下游发挥作用的靶基因,能够抑制MSC的细胞衰老。4.miR-29c-3p通过激活p53-p21和p16-pRB两条经典信号通路来促进MSC的细胞衰老。