纤维素酶是将纤维素协同催化降解生成葡萄糖的多种糖苷水解酶的总称。纤维素酶作为一种高效生物制剂,顺应了人们对清洁生产加工和可持续发展的要求,具有广阔的应用前景,现已成为世界第三大工业用酶。然而,纤维素酶在纺织染整加工过程中的存在织物强度损伤大、酶成本高和过程可控性差等问题,至今尚无完善的解决方案。目前,纤维素酶对天然纤维素纤维改性的研究大多是基于混合酶和复配酶展开的生产过程优化和参数调整,对纤维素酶的催化水解机理、不同纤维素酶分子的协同作用、同一纤维素酶分子中各活性结构域的功能仍不是十分清楚,对这些深层次问题的认识不足导致纤维素酶在纺织染整领域应用的可控性受到一定的限制。纤维素酶的研究开发多集中于木霉属和曲霉属来源的纤维素酶,而鲜见动物内源性纤维素酶及其结构域的催化水解机理和应用等研究工作的开展。本文通过基因克隆的方法构建新的重组绿色荧光福寿螺内源性内切纤维素酶EGA及其催化结构域CD质粒,在大肠杆菌中表达,镍柱亲和纯化获得高比活力的重组酶,探索纤维素酶在结合结构域CBD缺失的情况下对底物选择性及棉纤维作用后纤维形态、光致发光性、表面基团、结晶度和织物强度等性能的影响,该结果对动物内源性纤维素酶及其结构域的酶学理论基础和相关应用技术的研究具有重要的理论意义和实践指导价值。本课题的研究工作和结果主要在以下几个方面:1.利用基因工程方法构建含绿色荧光蛋白的EGA-GFP、CD-GFP重组表达载体。在大肠杆菌中表达重组绿色荧光蛋白,其最佳表达条件为:EGA-GFP和CD-GFP的最适反应温度分别为16℃和20℃;诱导剂IPTG最佳终浓度为0.1m M,诱导时间20 h以上能够获得最佳酶比活力和产量。镍柱亲和纯化获得的重组纤维素酶的荧光光谱相同,最大激发波长为390 nm,最大发射波长在508 nm,发射光谱位于可见光绿色光区。重组绿色荧光纤维素酶EGA-GFP和其催化结构域CD-GFP的最适p H值和p H值稳定性、最适反应温度和稳定稳定性与前期实验获得EGA和CD基本性质相似,略有差别,其原因可能是GFP的插入,使得酶分子的拓扑微结构变化而致。2.采用SDS-PAGE法研究重组纤维素酶EGA、结合结构域CBD和催化结构域CD对底物的选择性。研究结果表明:三种重组蛋白能够吸附到不同类型的纤维素底物上,但对不同底物的吸附结合能力有所差别。CD能够弱吸附到三种不同类型的纤维素,对底物不存在选择性;CBD和EGA对底物的选择性吸附一致,微晶纤维素Avice上吸附量均为最小。通过激光共聚焦法研究重组绿色荧光纤维素酶EGA-GFP和CD-GFP对棉纤维的吸附情况。结果表明:重组绿色纤维素酶EGA-GFP和催化结构域CD-GFP均能快速聚集到棉纤维表面形成绿色荧光薄层使纤维表面荧光强度逐渐增大。相同情况下,EGA-GFP吸附到棉纤维表面的荧光强度显著高于CD-GFP,且吸附速率快,说明结合结构域的存在有利于酶分子更快更强地吸附到棉纤维表面,软件分析结果表明上述两者吸附到棉纤维表面的酶浓度约有2倍之差。3.重组纤维素酶EGA-GFP和催化结构域CD-GFP在对棉织物(纤维)处理过程中都产生减重率、形态结构、纤维表面基团、纤维聚合度和织物拉伸性能等变化。纤维素酶EGA-GFP分子中结合结构域的存在,导致完整纤维素酶作用棉纤维过程中存在不完全可逆催化构象变化,纤维素酶EGA-GFP分子不能全部脱离底物结合点而重新寻找新的结合位点,使得部分酶分子只能固定于某一位点深度催化酶解,以致纤维素表面形成裂缝和洞穴,最终导致棉织物强力损失严重。催化结构域CD-GFP中CBD的缺失,使酶分子与底物的吸附不牢固,进而使催化结构域催化水解位点随机均匀地遍布纤维全表面,对纤维作用效果快,且强度损伤相对较小。基于上述现象,构建含CBD结构域的纤维素酶分子和缺失CBD结构域的活性催化结构域的两种重组酶催化水解棉纤维过程模型,揭示两者作用方式的差异性。4.纤维素酶与载体采用戊二醛交联固定化后,纤维素酶的储存稳定性有很大提高,可多次重复使用,相同的纤维素酶和不同载体交联方式不同,得到的固定化酶的性能也不同。苎麻织物经纤维素酶处理后,纤维表面的粗糙度、结晶度都呈现与酶活力相对应的变化。经酶活力较大的固定化纤维素酶较长时间(8h)处理后,纤维表面的粗糙度增加,其原因可能是纤维素酶酶解和固定载体共同作用所致。纤维素酶处理后未对苎麻织物结晶形态及结晶度产生明显变化。