IFN-λ又称III型干扰素是新发现的多基因细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤等生物学功能。IFN-λ能够有效保护上皮细胞免受病毒的感染,避免引发全身性炎症的风险,在临床上具有替代I型IFN的潜力,已成为当前IFN研究的热点。然而,当前商品化的IFN-λ重组蛋白主要来自发达国家,多用原核表达且价格昂贵。本课题主要研究了IFN-λ在哺乳动物细胞中的表达情况,利用亲和层析分离纯化重组蛋白,并鉴定其生物学活性,以期构建稳定表达细胞系;同时,由于原核蛋白表达系统具有成本低、产量高、稳定性好和纯化方便等优势,本研究也尝试了使用原核蛋白表达系统表达人源IFN-λ重组蛋白。实验目的:首先建立以哺乳动物细胞为平台的IFN-λ表达系统,以期获得具有天然构象和更高活性的人源IFN-λ重组蛋白;其次,利用慢病毒表达载体建立IFN-λ重组蛋白的转染系统,为获得稳定表达IFN-λ的CHO细胞系奠定基础;最后,建立以大肠杆菌为平台的IFN-λ表达系统,以期获得稳定性强、表达量高的IFN-λ重组蛋白。实验方法:首先优化IFN-λ1和IFN-λ3目的基因密码子并将其克隆到pc DNA3.1+载体Nhe I与Xho I多克隆位点之间构建分泌表达质粒;然后将其转染到HEK293T细胞,无血清培养48h后收集上清;分子筛浓缩上清后利用Western Blotting检测重组蛋白的表达情况和纯度;利用His TRIP HP镍柱分离纯化IFN-λ重组蛋白,最后检测重组蛋白的抗肿瘤和抗病毒生物学活性。同时利用无缝克隆技术构建IFN-λ慢病毒表达质粒,转染HEK293T细胞进行慢病毒包装,获得慢病毒颗粒,并进行初步转染实验。另外,删除IFN-λ基因信号肽序列,优化密码子后合成目的基因,将其插入到p ET26b（+）质粒Mscl与Xhol位点之间构建原核表达质粒,将质粒转化至BL21（DE3）大肠杆菌中,IPTG诱导表达,从而获得重组蛋白。利用His TRIP HP镍柱对IFN-λ重组蛋白进行分离纯化,并检测蛋白的生物学活性。实验结果:成功构建pc DNA3.1-IFN-λ1和pc DNA3.1-IFN-λ3分泌表达质粒,重组蛋白能够在HEK293T中有效表达,并成功分泌到细胞培养上清液及细胞中;纯化得到（2μg/ml）的重组蛋白与商品化的同类产品效果相当,能够有效诱导大量抗肿瘤相关基因,如ISG15、ISG54、OAS1、Max1和TRAIL的表达;激活凋亡相关p38信号通路;有效保护BHK21细胞免受水泡性口炎病毒（VSV）的感染。另外,本研究也成功构建了p WPXL-IFN-λ1和p WPXL-IFN-λ3慢病毒表达质粒,并获得包装病毒颗粒,初步转染成功。本研究也成功构建BL21/p ET26b-IFN-λ1和BL21/p ET26b-IFN-λ3原核表达菌株,通过IPTG诱导剂成功诱导出可溶性IFN-λ重组蛋白,但是重组蛋白在胞周质内表达量偏低,亲和层析纯化出的重组蛋白活性较低,有待于进一步优化实验条件。实验结论:成功构建了pc DNA3.1-IFN-λ1和pc DNA3.1-IFN-λ3分泌表达质粒,能够在HEK293T哺乳动物细胞上成功分泌表达具有抗肿瘤和抗病毒活性的IFN-λ1和IFN-λ3重组蛋白;成功构建了p WPXL-IFN-λ1和p WPXL-IFN-λ3慢病毒表达质粒,初步转染成功,为下一步构建稳定表达IFN-λ重组蛋白CHO细胞系奠定了基础;构建了p ET26b-IFN-λ1和p ET26b-IFN-λ3原核表达质粒,运用BL21（DE3）大肠杆菌原核表达系统表达出可溶性IFN-λ重组蛋白,为进一步完善IFN-λ原核表达系统奠定了基础。