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目的:索拉非尼(Sorafenib,SFB)是FDA批准用于晚期抗肝细胞癌(HCC)的多靶点多激酶抑制剂,但无靶向性,疗效有限。前期用纳米粒(NPs)负载SFB,静脉给药可降低给药频率与控制释药速率,但靶向性依然不够。本项目在优化负载SFB纳米粒基础上,应用针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)的特异性抗GPC3单克隆体(Anti-GPC3 Ab,克隆9C,墨西哥Bio Mosaics公司)修饰,获得具有HCC靶向、瘤内可控释药以及Ab与SFB联控抗HCC活性的Ab-SFB-NPs;研究Ab-SFB-NP纳米递药系统抗肝癌效应并揭示其抗肝癌分子机制,以提高SFB抗HCC疗效,为HCC治疗提供新途径。方法:(1)收集诊断明确的病理组织标本,应用免疫组织化学方法进一步分析验证GPC3在HCC中的表达、定位、阳性表达率以及在HCC中的特异性。(2)利用改进的纳米沉淀法制备负载SFB的纳米粒NP-SFB。首先己内酯在辛酸亚锡作用下与水溶性维生素衍生物TPGS反应生成TPGS-PCL;在二氯甲烷和吡啶的作用下,Pluronic P123与对甲苯磺酰氯反应生成P123-对甲苯磺酸酯(对甲苯磺酰基Pluronic P123,Pluronic P123-OTs),P123-OTs与邻苯二甲酰亚胺钾反应生成得到邻苯二甲酰亚胺基-Pluronic P123(Pluronic P123-PI),Pluronic P123-PI与水合肼在无水乙醇作用下生成双端氨基的P123(Pluronic P123-NH2),P123-NH2与1.2 N交联剂(SMMP)(3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯,N-succinimidyl 3-maleimidopropionate,SMMP)反应获得马来酰亚胺基聚丙二醇-聚乙二醇-聚丙二醇(PluronicP123-Mal);P123-Mal、TPGS-PCL与SFB按一定比例在丙酮环境条件下进行搅拌反应,获得负载SFB的纳米粒(SFB-TPGS-PCL/P123-Mal,NP-SFB)。(3)构建抗体修饰的纳米粒(Ab-SFB-NP)。利用traut’s试剂与抗体分子作用,把抗体分子中的伯胺基(-NH2)转换为巯基(-SH)得到巯基化抗体(Ab-SH),然后将NP-SFB和Ab-SH在室温下混合反应2 h得到抗体修饰的纳米粒(SFB-TPGS-PCL/P123-Ab,Ab-SFB-NP)。(4)应用核磁、红外、透射电镜、粒径电位仪等对载药纳米粒进行表征;应用高效液相色谱法(HPLC)对纳米粒载药量、包封率进行测定;应用GPC3阳性细胞Hep G2细胞测定NP-SFB-Ab的靶向性;MTT法检测纳米药物的生物相容性;动物给药实验评价纳米药物对机体各主要组织与器官的毒性。(5)MTT技术评估Ab-SFB-NP对肝癌细胞Hep G2的生物效应;Transwell与划痕实验观测Ab-SFB-NP对Hep G2细胞的侵袭与迁移能力的影响;流式细胞检测,Modfit软件分析Ab-SFB-NP对细胞周期的影响;WB检测Ab-SFB-NP对Hep G2细胞相关通路分子的影响与调控机制;进一步建立HCC的鼠模型,测试所制备的纳米药的体内抗HCC的效应,评估Ab-SFB-NP的体内抗肿瘤作用。结果:(1)GPC3在HCC组织中阳性率高GPC3在几乎所有的HCC中都有表达(32/35;91.4%),但仅有1例非HCC癌症GPC3表达,癌旁组织不表达GPC3;相对于Arg-1和Hep Par-1,GPC3对于HCC更具特异性与更高的阳性表达率。GPC3是HCC的一个理想的标志分子,可以作用HCC治疗的生物靶标,以利于药物靶向递送。(2)SFB-NP载药纳米粒成功构建1.本研究所制备的Ab-SFB-NPs经表征与检测显示,Ab-SFB-NPs包封率与负载率分别为75.9%与9.8%,均达到较高效率。2.TPGS和TPGS-PCL的核磁氢谱在4.08ppm和2.37ppm分别为聚己内酯上-OCCH2-和-CH2OOC-的特征峰,在3.66ppm处的尖峰单峰归因于TPGS氧乙烯单元的同系物的亚甲基质子。证实两亲性TPGS-PCL共聚物成功合成;双端氨基P123-NH2的元素分析结果显示氮元素的含量为0.37%,与预期结果相近,证明几乎大部分的P123接上了氨基;载药胶束的核磁氢谱图中3.57、3.42、1.15ppm为P123的特征峰,3.66ppm为水溶性维生素E的特征峰,证明P123-Mal与TPGS-PCL成功结合,其中7.28ppm均为氘代氯仿溶剂峰;FTIR图中2978cm-1存在的吸收峰归属于PCL的(-CH2)甲基伸缩振动所致,1732cm-1存在的吸收峰为TPGS的羰基振动峰,1107cm-1吸收峰为P123-Mal分子的C-O键伸缩振动及C-O-C骨架振动引起的,以上主要吸收峰在共聚物中均有体现,证明P123-Mal与TPGS-b-PCL很好地结合一起。3.GPC3+的Hep G2细胞对不同纳米粒的摄取效率检测结果显示Ab-SFB-NP被细胞摄取效率高于非抗体修饰的NP(SFB-NP),Ab-SFB-NP具体靶向细胞表面的GPC3的功能。4.生物相容性检测显示Ab-SFB-NP对正常的血细胞、血管内皮细胞相容性好,且对动物的主要组织与器官无明显的损伤,提示Ab-SFB-NP的组织相容性好。(1)Ab-SFB-NP纳米递药系统抗肝癌效应与机制Ab-SFB-NP对GPC3+肝癌细胞具有显著抑制效应,且其效率与GPC3在肿瘤细胞表面的表达量呈正相关;Ab-SFB-NP上调SFB诱导Hep G2细胞凋亡能力;Ab-SFB-NP纳米药可以有效地抑制肿瘤细胞的侵袭与迁移能力;WB检测结果显示Ab-SFB-NP相对于SFB-NP和游离SFB更有效抑制GPC3+的Hep G2细胞中的c-Maf/MEK/ERK信号通路,且抑制效应显著高于对GPC3阴性细胞HLF细胞内相应通路的抑制效应;进一步的WB结果显示Ab-SFB-NP不影响抗凋亡蛋白XIAP的表达水平,但下调Hep G2细胞中Mcl-1和C-FLIP的抗凋亡蛋白水平,结果显示SFB诱导半胱天冬酶依赖性细胞凋亡并下调Mcl-1和c-FLIP表达。(2)Ab-SFB-NP的体内抗肿瘤作用Ab-SFB-NP组显著抑制肿瘤生长,结果远优于SFB组和SFB-NP组。结论:本研究表明GPC3是HCC的一个理想的标志分子,可以作用HCC治疗的生物靶标,以利于药物靶向递送。所制备的GPC3抗体修饰的Ab-SFB-NPs纳米粒成功构建,经表征与检测显示具有较好的SFB包封率与较高的载药量,说明Ab-SFB-NPs具有GPC3分子靶向性。同时检测Ab-SFB-NPs纳米药有较好的生物相容性,体内、体外试验未发现明显毒性。Ab-SFB-NP主要通过抑制Raf激酶活性来下调MEK1/2和ERK的磷酸化,从而抑制RAF/MEK/ERK级联信号通路;此外,Ab-SFB-NP下调Mcl-1,导致Bax和Bak在线粒体膜上聚合以增强线粒体通透性并促进线粒体释放细胞色素C并促进细胞凋亡。因此,Ab-SFB-NP可以有效抑制HCC肿瘤的生长,本研究所制备的新型SFB纳米粒子Ab-SFB-NP成功开发用于肝癌的靶向治疗。