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近年来，罗非鱼养殖过程中链球菌病频繁爆发，严重影响了我国罗非鱼产业的可持续发展，目前链球菌病防控已成为罗非鱼养殖中的重点及难点。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是罗非鱼链球菌病的主要病原之一。LrrG蛋白是无乳链球菌表面较保守的蛋白之一，具有非血清型依耐性，是理想的候选疫苗抗原和免疫检测靶标。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性，本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列，设计特异性引物，扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因；利用NCBI的Conserved domain和PSIPRED分析LrrG蛋白的结构域和二级结构，DNAStar软件预测LrrG蛋白能否形成抗原表位；将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+)，构建重组表达质粒pET-32a(+)/LrrG，再导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，低温诱导表达LrrG蛋白；并以LrrG蛋白对罗非鱼分别进行注射和口服免疫实验，探究其免疫原性及最佳免疫方式。主要研究结果与结论如下：1罗非鱼无乳链球菌LrrG基因与氨基酸序列分析本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列，设计特异性引物，扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因。分析表明，其ORF为2361bp，编码786个氨基酸，与人源无乳链球菌LrrG基因（GenBank登录号：AY909605.1）核苷酸序列的相似性高达98.48%。DNAstar-EditSeq预测表明，罗非鱼无乳链球菌LrrG基因的ORF编码1条由786个氨基酸残基组成的肽链，相对分子量为88.5141kDa，理论等电点为9.26，分子式为C3951H6343N1095O1184S12，含有3个保守的LRR结构域。亲/疏水性分析表明，LrrG多肽链有3个主要的疏水区，亲水区域远大于疏水区域。DNAStar-Protean推测LrrG蛋白可以形成多个抗原表位。2罗非鱼无乳链球菌LrrG重组表达质粒的构建与原核表达将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+)，构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG，转入E.coli BL21(DE3)中，IPTG22℃诱导表达6h。SDS-PAGE显示，诱导表达蛋白的分子量为108.9kDa，并且该重组蛋白以可溶和包涵体2种形式存在。经His Bind亲和柱纯化获得LrrG纯蛋白，超滤管浓缩后LrrG可溶蛋白和包涵体蛋白浓度分别达3.40和3.19mg/mL。经Western blot检测，纯化后的LrrG可溶蛋白和包涵体条带单一、清晰。3罗非鱼无乳链球菌LrrG蛋白的免疫原性分析初步鱼体注射免疫实验表明，LrrG蛋白对罗非鱼的相对免疫保护率达69.28%，且免疫后4周的血清抗体滴度为1:800，免疫后2周血清抗体最大OD值为0.3515，免疫后4周为0.4635。采用PLGA作为佐剂，复乳溶剂挥发法制备PLGA-LrrG蛋白微球，微球平均粒径为4.5μm，包封率为38.54%，载药量为1.98%。体外释放曲线显示，该微球突释时间为前8h，突释量占27.74%，之后进入缓释阶段，28d的累积释放量达78.97%。PLGA-LrrG蛋白微球分别以注射和口服的方式免疫健康罗非鱼。各实验组均显示具有免疫保护力。注射0.5μg/g (蛋白量/鱼的体重)、1μg/gPLGA-LrrG蛋白微球，免疫保护率较高，分别达77.89%和77.81%；而注射2μg/gPLGA-LrrG蛋白微球免疫保护率略低。口服1μg/g PLGA-LrrG蛋白微球较口服0.5μg/g、2μg/g蛋白微球免疫保护率高，达77.54%。此外，注射组免疫保护率普遍高于口服组。罗非鱼经注射和口服方式免疫PLGA-LrrG蛋白微球后，其血清抗体水平和溶菌酶活性均显著高于对照组，注射组比口服组略高。空载PLGA微球与PBS组的血清抗体水平和溶菌酶活性均无显著差异，表明LrrG蛋白能够引起罗非鱼特异性和非特异性免疫反应。本研究表明，PLGA-LrrG蛋白微球可应用于罗非鱼无乳链球菌病的免疫预防，口服免疫1μg/g PLGA-LrrG蛋白微球，具有较好的免疫保护效果，且该免疫方式更为简单、生产可行性好。该研究为深入探讨无乳链球菌LrrG蛋白作为罗非鱼基因工程疫苗的潜在应用价值奠定了基础。