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钙调蛋白(CaM)在细胞增殖、分化、凋亡、迁移等过程中起着重要作用,它作为细胞内Ca2+信号的主要受体,在细胞周期的不同阶段调节着不同的功能。由于CaM本身并不具有任何酶活性,其发挥生物学效应的关键在于它能够和钙调蛋白结合蛋白(CaMBP)结合,引起CaMBP生物学活性的改变,进而参与生命活动的调控。因此寻找CaMBP及探究其相互作用机制显得尤为重要。
本课题首先通过免疫共沉淀及质谱的方法鉴定了在有丝分裂的不同时期与CaM相互作用的蛋白,我们总共鉴定出41个蛋白,包括锌指蛋白,核糖体蛋白,热休克蛋白等,它们以钙离子依赖或非依赖的方式结合,其中15个蛋白与CaM的结合呈现周期依赖性。蛋白印迹以及免疫荧光实验进一步证实了质谱结果的可信性以及与CaM的共定位现象。
在这些蛋白中,我们着重研究了热休克蛋白70kD(Hsp70)与CaM的周期依赖性结合,Hsp70属于细胞内分子伴侣蛋白,除涉及细胞内一些蛋白质分子构象和稳定性的调节之外,Hsp70对细胞应激、代谢、增殖以及凋亡等生理过程也均具有重要的调控作用。已有研究发现热休克反应能使胞内Ca2+浓度显著增加,从而会促进CaM与Hsp70的结合。然而对于两者作用的具体分子机理和作用尚未报导。
1、活细胞体内荧光共振能量转移(FRET)技术及体外免疫共沉淀结果表明,Hsp70与CaM存在时空特异性的结合,它们在间期细胞中发生相互作用,G1期在胞质中存在较弱的相互作用,随着S期的进入两者的相互作用逐渐增强且在胞核中结合最强。
2、实时活细胞观察及免疫荧光实验发现,过表达Hsp70与CaM后,Hsp70紧随CaM在S期入核,两者入核后抑制了细胞的生长,同时细胞发生了凋亡现象。
3、流式细胞检测及MTT结果表明,过表达Hsp70后使细胞阻滞在S期并引起细胞凋亡,而缺失CaM结合区域的Hsp70突变体则缓减了S期的阻滞以及细胞凋亡。这说明CaM与Hsp70的时空特异性结合调控着细胞周期的进程和凋亡。
4、我们通过紫外照射使DNA受损这种模型进一步研究CaM与Hsp70的相互作用,以及调控UV引起的S期阻断恢复及细胞凋亡的作用机理,我们发现当一定强度的UV(1.5kj/m2)照射细胞后,在DNA损伤修复的过程中,Hsp70与CaM的表达也从胞质向胞核转移然后又回到胞质,而且在这过程中Hsp70与CaM以及Bag-1的结合调控着Raf-1-ERK信号通路,从而调控着细胞周期的进程。但当UV照射能量(3kj)非常大时,此时DNA的损伤很严重而且细胞开始凋亡,在这过程中Hsp70与CaM一直在细胞核中表达,而我们也检测到P38MAPK的水平明显升高,同时并未检测到ERK的磷酸化水平,结果提示在高强度的刺激下,Hsp70可能不是经由Raf-1-ERK信号通路从而起到对细胞的保护作用,而是通过诱发凋亡信号通路从而使细胞无法恢复至使凋亡现象的发生,譬如P38MAPK信号通路或者JNK信号通路。
综上所述,我们发现Hsp70与CaM的时空特异性结合调控着S期的阻断恢复以及细胞凋亡过程,并影响到下游的Raf-1-Erk信号通路以及P38MAPK信号通路。