研究背景与目的乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤,20%乳腺癌患者HER-2过表达,当HER-2过表达及其相关信号通路激活导致细胞无限增殖,最终会导致肿瘤容易发生侵袭和转移,预后较差。Herceptin(商品名:赫赛汀)是抗HER-2的人源化单抗,赫赛汀的出现使很多HER-2阳性的乳腺癌患者得到显著的疗效,但经常会在使用了一年左右开始出现赫赛汀耐药,使得治疗失败。虽然对于赫赛汀耐药机制的探索已经历了十多年,但至今仍未完全解决赫赛汀耐药。因此,彻底阐明赫赛汀耐药机制将有助于提高HER-2阳性乳腺癌病人的生存率。肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性细胞的细胞,越来越多的证据证实肿瘤干细胞的存在是肿瘤耐药的重要原因之一。乳腺癌中也被证实由于乳腺癌干细胞的存在,使得乳腺癌更易复发并且趋于难治。大量研究报道表明,Hedgehog信号通路的激活能增强乳腺癌干细胞特性。Liu等人发现了在乳腺癌干细胞上IHH、SMO、Gli1、Gli2的表达明显高于已分化的肿瘤细胞,阻断Hedgehog信号通路后能明显减少微球体的形成,证实了乳腺癌干细胞中的Hedgehog信号通路被激活[1]。Tanaka等人发现,从乳腺癌细胞株MCF-7中分选出CD44+CD24-细胞中的SHH、Gli1高表达,通过加入SMO抑制剂环巴胺培养72h后,CD44+CD24-在MCF-7中的比例明显降低[2]。近年来也有文献报道TGF-β/Smads信号通路激活也能增强肿瘤干细胞特性。从三阴性乳腺癌CD44+CD24-的干细胞群、干性标志物、干细胞样间质细胞表型、干细胞自我更新能力以及侵袭能力等方面证实了TGF-β1可以增强三阴性乳腺癌干细胞自我更新能力等干细胞特性[3]。Hedgehog及TGF-β/Smads信号通路中的多个重要成分都可以被泛素化调节。在Hedgehog信号通路的激活过程,跨膜受体PTCH与SHH配基结合并内化入细胞,同时SMO富集到原纤毛中,这种膜受体内吞转运的过程中,泛素化修饰,特别是多位点的单泛素化修饰是促进膜受体内化转运的关键信号之一。在TGF-β/Smads信号通路激活的过程中,Smurfs是一类含有HECT结构域的E3泛素连接酶,是一种能特异性介导Smads分子泛素化降解的调节因子。CUL家族作为体内重要的泛素化酶E3的主要骨架,与泛素激活酶E1、泛素转移酶E2共同组成泛素-蛋白酶体系统(ubiqutin-proteasomesystem,USP),具有调节细胞周期、凋亡,细胞增殖和信号转导方面的作用,在蛋白质修饰中也有重要的意义,其中由CUL与SKP1、Fbx29(也称为Fbw8)、ROC1组成了SCF-ROC1样E3泛素连接酶复合物是整个泛素化过程关键的结构[4]。我们前期的研究发现,无论是在乳腺癌组织还是在乳腺癌细胞中,CUL7的表达与乳腺癌恶性程度呈正相关,即CUL7高表达的乳腺癌组织或者乳腺癌细胞,其侵袭、转移的能力明显增强;同时,体外抑制CUL7的表达明显削弱乳腺癌细胞的侵袭和转移。然而肿瘤耐药和转移并不是孤立的两个过程。研究发现,在细胞膜表达的P-gp和CD44分子可以通过直接相互作用,影响了肿瘤细胞的耐药性及转移侵袭能力,表明P-gp的高表达有助于增强肿瘤细胞的存活及转移侵袭能力,提示了耐药与转移侵袭之间存在着密切的关系,及其存在的复杂多样的调控因素[5-6]。在我们的预实验中,通过比较HER-2阳性乳腺癌赫赛汀耐药细胞(SKBR3/POOL2)和亲本细胞(SKBR3)中CUL7的表达,发现CUL7在HER-2阳性乳腺癌耐药细胞中也呈现高表达。有限的研究证实,赫赛汀耐药的胃癌细胞获得了肿瘤干细胞样表型[7]。因此,我们推测CUL7作为CUL家族的一员,可能也通过泛素化调控Hedgehog、TGF-β/Smads信号通路的相关分子,促进肿瘤干细胞生成,诱发乳腺癌赫赛汀耐药。故本实验将通过RT-PCR、Western-Blot、基因干扰实验、免疫荧光实验、细胞流式等技术、以及免疫组化及裸鼠体内实验等,从多个方面证实CUL7对乳腺癌赫赛汀耐药的影响,并初步探讨其可能的分子机制。研究方法1.选取HER-2阳性乳腺癌赫赛汀耐药细胞(SKBR3/POOL2)和亲本细胞(SKBR3),并通过实时荧光定量RT-PCR、western blot技术检测两组细胞中CUL7 mRNA和蛋白表达水平;2.构建CUL7 shRNA慢病毒载体,通过嘌呤霉素筛选得到稳定干扰CUL7表达的细胞株(SKBR3/POOL2-shRNA)和阴性对照(SKBR3/POOL2-NC);并通过实时荧光定量RT-PCR、western blot技术检测SKBR3/POOL2-shRNA和SKBR3/POOL2-NC中CUL7 mRNA和蛋白表达水平;3.MTT法和流式细胞仪检测赫赛汀药物对SKBR3、SKBR3/POOL2、SKBR3/POOL2-shRNA、SKBR3/POOL2-NC凋亡的影响;通过平板克隆形成实验和流式细胞仪检测CUL7对细胞增殖能力的影响;通过划痕实验和transwell验证CUL7在细胞迁移、侵袭中的作用;4.通过western blot、流式细胞仪和细胞成球实验探讨CUL7与肿瘤干细胞特性的相关性,并通过western blot检测各个细胞中Hedgehog、TGF-β/Smads信号通路中靶基因SHH、PTCH、Gli1、Gli2、TGF-β1、TGF-β2、p-smads2/3蛋白表达变化;5.收集赫赛汀敏感及耐药的乳腺癌组织标本,通过免疫组化检测敏感及耐药的乳腺癌组织中CUL7、Hedgehog及TGF-β/Smads信号通路中重要分子蛋白的表达差异;6.在裸鼠体内验证CUL7对成瘤能力的影响,及予赫赛汀治疗后肿瘤的变化。结果1.通过MTT测赫赛汀在SKBR3、SKBR3/POOL2细胞中的IC50值分别是3.58ug/ul、5.48ug/ul。实时荧光定量RT-PCR和western blot的结果均显示CUL7在耐药细胞SKBR3/POOL2中表达明显高于亲本细胞SKBR3。2.利用shRNA CUL7干扰耐药细胞株,获得CUL7表达下调的细胞株SKBR3/POOL2-shCUL7及其对照细胞株SKBR3/POOL2-NC。通过实时荧光定量RT-PCR、western blot证实,在SKBR3/POOL2-shCUL7细胞株中,CUL7基因和蛋白分别下调了52%和64%。通过MTT法测得赫赛汀在SKBR3/POOL2-NC和SKBR3/POOL2-shCUL7的IC50值分别是5.28ug/ul和4.60ug/ul。3.流式细胞术检测细胞凋亡水平发现:SKBR3、SKBR3/POOL2、SKBR3/POOL2-shRNA、SKBR3/POOL2-NC细胞经赫赛汀诱导12h后的凋亡水平变化分别是:19.90%增加至50.10%,16.51%增加至16.94%,15.26%增加至18.15%;16.68%增加至17.38%。结果提示下调CUL7后SKBR3/POOL2对赫赛汀敏感性明显升高。4.通过平板克隆形成实验发现CUL7高表达细胞(SKBR3/POOL2和SKBR3/POOL2-NC)克隆形成率明显高于CUL7低表达细胞(SKBR3和SKBR3/POOL2-shRNA)。通过流式细胞仪发现通过赫赛汀诱导24h后,敏感细胞SKBRS的S期所占的比例由16.62%降至2.66%;而耐药细胞SKBR3/POOL2从13.84%降至10.98%;下调CUL7的SKBR3/POOL2-shRNA细胞从24.64%降至10.04%;而其对照组SKBR3/POOL2-NC从17.63%降至11.55%。提示下调CUL7可以阻滞细胞进入细胞周期,证实了下调CUL7使得耐药细胞的增殖能力降低。5.通过划痕实验和transwell实验,发现下调了CUL7表达的SKBR3/POOL2-shRNA细胞,与对照组SKBR3/POOL2-NC细胞相比,其迁移、侵袭能力明显下降。这些结果提示,CUL7对乳腺癌细胞的迁移侵袭能力具有促进作用。6.通过流式细胞仪检测SKBR3、SKBR3/POOL2、SKBR3/POOL2-shRAN、SKBR3/POOL2-NC细胞中具有CD44+CD24-表型的细胞所占比例分别是0.607%、4.73%、2.44%、13.9%;细胞成球实验发现CUL7低表达组细胞(SKBR3、SKBR3/POOL2-shRNA)的乳腺球的体积明显减小,数目也明显降低;Western blot检测到CUL7高表达组(SKBR3/POOL2、SKBR3/POOL2-NC)的NANOG蛋白水平明显增高。以上实验均证明了CUL7能够促进乳腺癌细胞干性形成。7.通过western blot发现CUL7低表达组细胞(SKBR3、SKBR3/POOL2-shRNA)在Hedgehog信号通路的重要分子蛋白(SHH、Gli1、Gli2)水平较CUL7高表达组细胞(SKBR3/POOL2、SKBR3/POOL2-NC)显著降低,而PTCH2水平较CUL7高表达组显著升高;而在TGF-β/Smads信号通路的重要的分子蛋白(TGF-β1、TGFβ2、p-smad2、p-smad3)水平,CUL7低表达组(SKBR3、SKBR3/POOL2-shRNA细胞)与CUL7高表达组(SKBR3/POOL2、SKBR3/POOL2-NC)间未见明显差异。结果提示CUL7可能通过Hedgehog信号通路影响乳腺癌细胞干性。8.通过免疫组化检测乳腺癌组织,发现CUL7高表达在敏感与耐药乳腺癌组织中分别占30%、66.67%;PTCH2、Gli1、Gli2在敏感组织中高表达分别占60%、10%、30%,而在耐药组织中分别分别占22.22%、55.56%、77.78%;在TGF-β/Smads信号通路中的p-smad2在敏感与耐药乳腺癌组织中高表达分别占40%、44.44%。结果提示在耐药乳腺癌组织中CUL7以及hedgehog信号通路分子SHH、Gli1、Gli2普遍呈现高表达,而PTCH2呈现低表达;在敏感与耐药的乳腺癌组织中TGF-β/Smads信号通路分子未见明显差异。提示CUL7可能通过激活Hedgehog信号通路影响乳腺癌赫赛汀的敏感性。9.从绘制的肿瘤生长曲线图中,我们可以看出CUL7低表达的SKBR3和SKBR3/POOL2-shRNA细胞的成瘤能力明显下降(P<0.05)。分别予赫赛汀及盐水治疗后,发现在CUL7高表达组的SKBR3/POOL2和SKBR3/POOL2-NC无论是否给予赫赛汀治疗,肿物大小都明显呈上升趋势;在CUL7低表达的SKBR3和SKBR3/POOL2-shRNA无论是否给予赫赛汀治疗,肿物大小明显减小。结果提示高表达CUL7的细胞表现出具有更强的致瘤能力。结论1.CUL7可能是乳腺癌赫赛汀耐药的标志物之一。2.CUL7可能通过影响乳腺癌干细胞从而导致耐药。3.CUL7可能激活HH信号通路影响乳腺癌干细胞特性。