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前言移植免疫排异仍然是目前器官移植领域亟待解决的主要问题之一，临床上移植物被排斥的免疫过程由几个紧密相关的步骤参与完成，包括同种异体抗原的递呈和识别；受体T细胞的激活和增殖，淋巴细胞浸润到移植物中，最后由效应T细胞介导对移植物的损伤和破坏。在上述的这一系列过程中，T细胞起到一个中心作用，而在T细胞激活、增殖和产生效应的各个阶段都有整合素的参与，白细胞功能相关抗原-1(Leukocyte function associated antigen-1，LFA-1)是分布最广也是最重要的T细胞整合素，在T细胞黏附到血管内皮上，进入淋巴结与抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)接触，为T细胞活化提供共刺激信号，浸润进入移植物等过程中起重要作用。LFA-1的活性受到严格的调控，以决定T细胞与其他细胞之间的黏附性和T细胞的活化阈值。在参与调控LFA-1活性的诸多分子中，除了激酶和磷酸酶，新近发现的一组造血组织特异表达的适配蛋白在T细胞信号途径中起重要作用。该组适配蛋白本身不具有酶的活性或受体功能，但它拥有多个结合位点，可通过与其他蛋白的结合形成多蛋白信号复合体，因此一个适配蛋白可能调节多种细胞功能。黏附脱颗粒促进适配蛋白(Adhesion and-Degranulation Promoting Adapter Protein，ADAP)，就是这样一种传导T细胞受体(Tcell receptor，TCR)偶联信号到LFA-1激活的适配蛋白分子，其在T细胞激活和增殖中产生不可取代的作用。ADAP主要在T细胞和髓系细胞上表达，在TCR刺激后可被磷酸化。共有两种不同分子量(120和130 kDa)的同功体存在，ADAP-120主要在胸腺T细胞上表达，而ADAP-130则主要在外周T细胞上表达。目前关于ADAP的主要功能已经被阐明，ADAP主要正向调节TCR偶联到LFA-1激活的信号传导及其介导的细胞活化、增殖、IL-2的产生和细胞黏附。以上的实验结果是通过ADAP基因敲除(ADAP-／-)小鼠和转基因细胞正、反两方面来证实的。另外，ADAP还调节β1整合素介导的细胞黏附以及TCR到细胞骨架蛋白重塑的信号传导。关于LFA-1在移植免疫排异中的作用，已有大量报道，阻断LFA-1活化及其与受体ICAM-1的结合能在多种移植模型中获得移植物存活时间的延长，甚至能成功诱导耐受。根据ADAP在T细胞功能尤其是LFA-1激活中的重要调节作用，我们推测ADAP在器官移植免疫排异中有重要作用，但目前尚无这方面的报道，因此本研究在ADAP-／-小鼠基础上进行一系列的移植研究实验，总体分为四个方面的探索：一、从ADAP-／-小鼠分离淋巴细胞，以同种异体树突状细胞(Dendritic cell，DC)作为刺激，模拟体内的排异刺激状况，体外研究ADAP在淋巴细胞增殖反应中的作用。二、建立体外和体内细胞毒淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)体系，检测ADAP在T细胞效应阶段的作用。三、以ADAP-／-小鼠作为受者，以皮肤移植和心脏移植模型检测ADAP在血管化和非血管化器官移植中的作用。四、建立小鼠异位小肠移植模型，研究ADAP在免疫原性很强的小肠移植中的作用，联合共刺激通道阻断和ADAP基因缺失研究该方案在抑制小肠移植排异中的作用。材料与方法1、建立体外混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction，MLR)体系，分别以CFSE稀释法和3H掺入法检测T细胞的增殖反应。2、建立体外和体内CTL系统，分别以Cr-51和CFSE标记靶细胞，检测并比较ADAP-／-和野生型效应细胞对靶细胞的破坏作用。3、小鼠心脏移植采用腹部异位移植方法，小鼠皮肤移植采用背部移植方法。4、心脏和皮肤移植实验动物分成两组：供者小鼠均为BALB／C小鼠(H-2d)，受者小鼠为野生型C57BL／6小鼠(Wild type，WT)(H-2b)或ADAP-／-小鼠。5、小鼠心脏移植物病理组织学分析包括光镜下HE染色，多重免疫荧光染色各淋巴细胞亚群，免疫组化染色活跃增殖淋巴细胞。6、小鼠小肠移植采用腹部异位移植方法。7、小肠移植实验动物分组：供者小鼠为BALB／C小鼠(H-2d)，受者小鼠为野生型C57BL／6小鼠(Wild type，WT)(H-2b)和ADAP-／-小鼠。分为1组：受体为WT小鼠，2组：受体WT接受MR-1(抗CD40L单抗)治疗，3组：受体为ADAP-／-小鼠，4组：受体ADAP-／-小鼠接受MR-1治疗。MR-1在术后当天给予静脉注射500μg，相同剂量的药物在术后2、4、7天经静脉注射给药。8、小肠移植物病理排异评分采用移植后14天，取移植肠进行HE染色，光镜下观测移植物形态并行移植物排异评分。9、心脏移植物中浸润的淋巴细胞和小肠移植物各部分淋巴细胞的分离，采用胶原酶A消化，及密度梯度离心法。10、分离获得的淋巴细胞，以多种荧光素偶联的大鼠抗小鼠单抗孵育染色，流式细胞仪分析细胞组成及活化比例。结果1、ADAP-／-CD4+和CD8+T细胞经过同种异体DC或抗CD3／抗CD28刺激后的增殖反应明显减弱和延迟，同时产生的IL-2也显著比野生型T细胞少。2、ADAP-／-T细胞的体外和体内CTL效应与野生型相比无显著差异。3、ADAP-／-小鼠移植心脏的存活时间明显延长，而皮肤移植物的存活时间与野生型相比无差异。4、ADAP-／-小鼠心脏移植物中的T细胞，包括CD4+和CD8+T细胞的浸润都明显减少，B细胞和粒细胞的浸润与野生型相似。5、ADAP-／-小鼠心脏移植物中的活跃增殖的淋巴细胞比野生型明显减少。6、流式细胞仪的定量检测也显示ADAP-／-小鼠移植心脏中CD4+和CD8+T数减少，并且CD8+T细胞的活化比例也明显减少。7、ADAP-／-小鼠小肠移植物的排异程度有所降低，但仍有移植肠绒毛结构的破坏。8、MR-1单一治疗对抑制小肠移植排异无明显作用。9、MR-1治疗联合ADAP基因缺失能有效抑制小肠移植排异，保护移植肠绒毛结构的完整性。10、MR-1治疗联合ADAP基因缺失明显减少移植肠MLN中受体来源CD4+和CDS+T细胞浸润，同时降低受体CDS+T细胞的活化比例。11、ADAP基因缺失以及联合MR-1治疗能降低移植肠潘氏结中活化／静息细胞比例，并能减少记忆淋巴细胞比例。12、ADAP基因缺失以及联合MR-1治疗能减少受体CD4+和CD8+T细胞的浸润，增加移植肠浸润细胞的供体／受体比例，更好地保存供体来源细胞。结论1、同种异体心脏和小肠移植物在ADAP缺失的受者中存活时间延长，但最终仍可引起免疫排异反应。2、ADAP缺失对移植物的保护作用主要是通过抑制淋巴细胞活化、增殖和IL-2产生以及向移植物浸润的过程来实现的。3、ADAP缺失联合共刺激通道阻断对有效抑制小肠移植物的排异反应有协同作用。4、ADAP主要在同种异体移植免疫反应的早期诱导阶段发挥作用，而对效应阶段无明显影响。