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目的:1.探索不同浓度平阳霉素(PYM)诱导喉癌细胞死亡的两种不同模式:低浓度致细胞坏死,阻滞细胞周期于G2/M期,高浓度诱导细胞凋亡。2.研究两种模式的量-效、时-效关系。3.评价两种模式的临床意义,为临床喉癌的药物治疗提供实验依据和新思路。
方法:取人喉鳞状细胞癌株Hep-2进行细胞培养至对数生长期,PYM作用不同浓度分组:1、10、100、1000μg/ml,作用不同时间分组:12、24、48h。用MTT(四唑盐)比色法检测细胞存活率;吖啶橙和TUNEL染色,观察PYM所致凋亡细胞形态学特点,并区分凋亡和坏死;同时在透射电镜下观察细胞超微结构变化;琼脂糖凝胶电泳从生化角度区分凋亡与坏死。流式细胞仪检测凋亡率,测定细胞周期。
结果:MTT观察到各实验组与对照组相比存活率降低(P<0.01除1μg/ml12h外),不同浓度组之间以及不同时间组之间相比较P<0.01,细胞存活率1μg/ml24h(86.75±6.80)%;1000μg/ml24h(45.25±8.66)%,P<0.01。形态学吖啶橙荧光染色、TUNEL染色、透射电镜可见高浓度(100,1000μg/ml)PYM作用下,细胞呈典型凋亡改变,表现为细胞体积变小,核染色质固缩,呈新月形、环形在核膜周边聚集,可见膜出泡及凋亡小体形成。低浓度(1,10μg/ml)PYM作用下细胞则呈坏死改变,胞体变大,胞膜破裂,核染色质减少分布不均,细胞器结构破坏。生化指标琼脂糖凝胶电泳可见,PYM1000μg/ml组作用12、24h电泳谱呈典型的“梯状带”,1、10、100μg/ml组作用各时间段电泳所见均为弥散一片(diffusesmear)。流式细胞仪观察到,高浓度(100,1000μg/ml)出现凋亡峰,低浓度细胞周期阻滞于G2/M期,随时间延长G2/M期阻滞作用增强,同时出现多个坏死所致低平小峰。细胞的凋亡率随PYM的作用时间和浓度的增加而增加。培养24h凋亡率,1000μg/ml组为(45.23±5.36)%;10μg/ml组为(3.40±0.23)%;对照组为(3.11±0.16)%,(P<0.01)。
结论:1.不同浓度的PYM引起Hep-2细胞两种不同死亡模式。低浓度的PYM致Hep-2细胞发生坏死,细胞周期阻滞于G2/M期;高浓度的PYM则诱导Hep-2细胞出现凋亡。2.PYM有诱导Hep-2细胞发生凋亡及抑制细胞增殖的作用,作用方式呈时间-浓度依赖方式。