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研究目的三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer;TNBC)由于对内分泌治疗及分子靶向治疗不敏感,复发后快速进展,临床治疗TNBC面临巨大挑战。研究发现乳腺癌干细胞在乳腺癌发生发展、复发、转移和治疗抵抗中起重要作用。近年来,槐耳在肿瘤防治方面的作用引起了关注,并发现槐耳可抑制乳腺癌细胞的增殖、浸润和转移。然而,槐耳对于TNBC的抑制机理尚未完全明了。本研究目的在于探索槐耳对TNBC生物学行为的影响及其作用机制,为槐耳的临床应用提供药理学依据,为TNBC的综合治疗提供参考。研究方法和结果在本研究中,我们拟以槐耳清膏为研究药物,初步探讨槐耳对TNBC的抑制作用及其作用机制,具体包括以下2个部分:第一部分槐耳对原发性三阴性乳腺癌的抑制作用方法通过MTT比色法实验检测槐耳对TNBC细胞株MDA-MB-231细胞活性的影响,并通过Transwell实验测定槐耳对该细胞侵袭和迁移的影响。使用流式细胞术检测槐耳对MDA-MB-231细胞周期及凋亡的影响。最后,通过蛋白印迹法分析槐耳对MDA-MB-231细胞中PI3K/AKT/m TOR通路中相关蛋白的影响。结果MTT比色法实验结果显示槐耳以剂量依赖的方式显著抑制MDA-MB-231细胞的活力,并在10mg/ml的浓度下及作用24小时后能够起到有效抑制作用。槐耳作用于MDA-MB-231细胞24h、48h及72h的半数抑制浓度(IC50)分别为6.508±0.648mg/ml、4.207±0.453mg/ml及2.281±0.164mg/ml。同时Transwell实验结果显示槐耳能够体外抑制MDA-MB-231细胞的迁移。流式细胞仪检测发现,槐耳能够诱导MDA-MB-231细胞周期阻滞在G2/M期。另外,经槐耳处理的MDA-MB-231细胞晚期凋亡率和早期凋亡率均有所增加,说明槐耳能够促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡。机制研究表明,槐耳抑制PI3K/AKT/m TOR通路中相关蛋白包括PI3K、AKT、p-AKT和m TOR的表达,从而能够抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。第二部分槐耳对三阴性乳腺癌干细胞的影响方法利用MTT比色法实验检测槐耳对TNBC悬浮细胞球中细胞活性的影响,并观察悬浮细胞球体积和数量的变化。通过克隆形成实验检测槐耳对乳腺癌克隆形成能力的影响。另外,通过流式细胞术检测槐耳对CD44+/CD24-肿瘤干细胞细胞比例的影响,并利用定量聚合酶链反应分析槐耳对肿瘤干细胞标记物的影响。结果MTT比色法的结果表明,槐耳能够抑制MDA-MB-231悬浮细胞球的细胞活性,并降低悬浮细胞球的数目和大小。在克隆形成实验中,我们发现槐耳可显著降低乳腺癌的克隆形成能力。流式细胞学实验表明,槐耳能够显著减少CD44+/CD24-细胞的数目;与对照组相比,CD44+/CD24-的细胞百分比下降了49.20%(2mg/ml)。此外,槐耳组MDA-MB-231细胞中的常见的肿瘤干细胞标记物Oct-4,Nestin和Nanog的m RNA水平也显著降低。结论1.槐耳能够抑制TNBC细胞系MDA-MB-231的细胞活力、侵袭和迁移;2.槐耳能够抑制PI3K/AKT/m TOR通路,并诱导MDA-MB-231细胞周期阻滞在G2/M期,从而抑制TNBC细胞MDA-MB-231的增殖;3.槐耳明显抑制MDA-MB-231悬浮细胞球的活力、生长及其克隆形成能力;4.槐耳明显减少CD44+/CD24-肿瘤干细胞的在肿瘤细胞中的比例。