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三羟基雄甾烯酮（7α,15α-diOH-DHEA）是女用口服避孕药“优思明”的关键中间体,可以通过微生物在去氢表雄酮（DHEA）的C7α位和C15α位依次引入羟基获得。本实验室前期从亚麻刺盘孢Colletotrichum lini ST-1中挖掘获得一个能双羟化DHEA生成7α,15α-diOH-DHEA的P450氧化酶CYP-c13,初步实现了其在毕赤酵母的异源表达,然而仍存在酶活力不高、双羟化机制不明确等问题。本文以该重组毕赤酵母作为出发菌株,通过发酵条件优化进一步提高重组毕赤酵母中P450氧化酶CYP-c13的酶活力。在此基础上,分离纯化获得纯酶,并对其酶学性质进行系统研究。主要研究结果如下:（1）重组毕赤酵母的发酵条件优化。通过单因素试验和正交试验对重组毕赤酵母的发酵条件进行了优化,确定重组毕赤酵母的最适发酵条件为:诱导pH8.0,甘油浓度1.5%,甲醇浓度1.5%,YNB添加量1.6%,装液量100 mL/500 mL,诱导时间为72 h。在该发酵条件下,P450氧化酶CYP-c13的酶活从4811 U·mL-1提高到7392 U·mL-1,是优化前的1.5倍。在此基础上,研究了优化后的重组毕赤酵母对DHEA的转化过程曲线,发现重组毕赤酵母先对DHEA的C7α位羟化生成单羟产物7α-OH-DHEA,再对7α-OH-DHEA的C15α位羟化生成双羟产物7α,15α-diOH-DHEA。（2）P450氧化酶CYP-c13的分离纯化。重组毕赤酵母粗酶液经过硫酸铵沉淀、Ni-NTA亲和层析和Superdex G-75凝胶过滤层析等分离纯化步骤,成功获得了P450氧化酶CYP-c13纯酶。CYP-c13的比酶活从88.4 U·mg-1提高到447.6U·mg-1,纯化倍数为5.1倍,回收率为2.8%。（3）P450氧化酶CYP-c13的酶学性质研究。首先研究了温度、pH以及金属离子等因素对P450氧化酶CYP-c13酶活力的影响。结果发现:CYP-c13的最适温度为30oC,最适pH为7.0,低浓度下,金属离子Na+、K+、Mg2+和Mn2+对CYP-c13有轻微的促进作用;高浓度下,所有的金属离子对CYP-c13均有不同程度的抑制作用。对CYP-c13的底物特异性研究发现其能够对包括黄体酮、雄烯二酮、沃氏氧化物、睾酮和坎利酮在内的5种甾体化合物具有单羟化作用,其中,对雄烯二酮、沃氏氧化物和坎利酮具有双羟化作用。（4）CYP-c13对底物DHEA和单羟副产物7α-OH-DHEA的动力学参数研究。测定了CYP-c13对底物DHEA和单羟副产物7α-OH-DHEA的Km值和kcat值,结果发现:与7α-OH-DHEA相比,CYP-c13对DHEA的亲和力更大且催化效率更高。在此基础上,通过计算机模拟初步解析了造成CYP-c13与底物DHEA和单羟副产物7α-OH-DHEA亲和力存在差异的原因。