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第一部分(HydroxysaffloryellowA,HYSA)对H9c2心肌细胞的活力影响目的:冠脉介入治疗、冠脉搭桥和冠脉溶栓等治疗手段是目前临床心脏相关疾病治疗的主要手段,但是伴随而来的是该类手术术后易导致的心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)损伤的出现,而造成的二次损伤严重影响患者健康。HYSA是黄酮类物质,中药红花中的主要活性成分,其对血管组织细胞损伤具有明显的保护作用,但HYSA在缺血再灌注损伤中的保护作用还有待研究。方法:本实验釆用H9c2心肌细胞培养体系,建立缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation H/R)心肌损伤模型,通过MTT实验首先考察HYSA对心肌细胞的存活率的影响;在此基础上,检测细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),丙二醛(Methane dicarboxylic aldehyde,MDA)含量,考察HYSA对细胞存活率及氧化应激损伤的影响;同时给于PI3K,HKII,ERK抑制剂考察给予抑制剂后HSYA对H/R H9c2细胞模型的影响。结果:1与正常组比较,H/R细胞模型组细胞存活率明显降低,给于模型细胞不同剂量的HSYA后,随着给药剂量的增高,表现出明显的保护作用。2与正常组相比较,当给于PI3K抑制剂LY294002或HKII抑制剂3-BrPA后,HSYA保护作用明显降低,与未给予抑制剂具有显著差异。而给于ERK抑制剂后,其对HSYA的心肌细胞保护作用影响较弱,但与单一给于HSYA干预组无显著差异。3与正常组相比较,模型组细胞LDH显著升高,说明细胞线粒体损伤明显增加,给于HYSA后LDH显著下降与模型组具有显著差异;但是当给于PI3K抑制剂LY294002或HKII抑制剂3-BrP后,HSYA保护作用显著降低,而给于ERK抑制剂后,其对HSYA的心肌细胞保护作用虽有所抑制,但与单一给于HSYA干预组没有显著差异。4与正常组相比较,h/r细胞模型组细胞sod显著降低,mda显著升高,说明细胞氧化应激反应明显增加。给于模型细胞hsya后表现出明显的保护作用,显著升高sod并降低mda含量与模型组具有显著差异。但是当给于pi3k抑制剂ly294002及hkii抑制剂3-brpa后,hsya改善细胞氧化应激反应的作用明显降低;而给于erk抑制剂后,其对hysa的心肌细胞保护作用有所抑制,但与单一给于hsya干预组没有显著差异。第二部分hysa对h9c2心肌细胞线粒体及能量代谢的影响目的:线粒体在miri中起关键性作用。线粒体是细胞能量的供应器,miri发生时,氧化应激反应可导致细胞线粒体功能紊乱,影响线粒体正常能量供应,降低atp合成;同时氧化应激反应可以引起线粒体中细胞色素c的释放,继而激活caspase3,触发细胞凋亡的发生,hysa在h9c2心肌细胞h/r模型中具有一定保护作用可改善氧化应激反应,对于细胞线粒体功能是否具有保护作用有待考察。方法:本研究通过考察h9c2细胞atp含量,胞浆及线粒体中细胞色素c含量的变化,考察hsya对h/rh9c2细胞线粒体的保护作用,同时通过考察细胞中caspase3活性及采用annexin-v-fitc双染考察细胞凋亡,评价hysa在细胞凋亡中干预作用。结果:1与正常组相比较,h/r细胞模型组细胞atp含量显著降低;给于模型细胞hysa可使atp显著升高与模型组具有显著差异;同时给于pi3k抑制剂ly294002或hkii抑制剂3-brpa后,atp明显降低与单一hsya干预组具有显著差异;而给于erk抑制剂后,与单一给于hsya干预组没有显著差异。2与正常组相比较,h/r细胞模型组的细胞胞浆中细胞色素c含量显著升高,线粒体中细胞色素c含量明显降低;给于模型细胞hsya后,可以明显降低胞浆中的细胞色素c含量,升高线粒体中含量,表现出明显的保护作用。给于pi3k抑制剂ly294002或hkii抑制剂3-brpa后,hsya保护作用明显降低,胞浆中细胞色素c含量较hysa组明显升高,线粒体中细胞色素c含量降低,与hysa组具有显著性差异。而给于erk抑制剂后,与单一给于hsya干预组没有显著差异。3与正常组相比较,h/r细胞模型组细胞caspase3含量显著升高;给于模型细胞hsya后,caspase3含量显著降低与模型组具有显著差异;同时给于pi3k抑制剂ly294002或hkii抑制剂3-brpa后,hsya保护作用明显降低,caspase3含量明显升高与hysa组具有显著差异;给于erk抑制剂后,与单一给于hsya干预组没有显著差异。4与正常组相比较,h/r细胞模型组细胞凋亡显著升高;给于模型细胞hsya后细胞凋亡明显降低,与模型组具有显著差异;同时给于pi3k抑制剂ly294002或hkii抑制剂3-brpa后,凋亡明显升高,hsya抑制凋亡作用明显降低;但给于erk抑制剂后,与单一给于hsya干预组相比影响较小。第三部分hysa对h9c2心肌细胞akt,gsk-3β,hexokinaseii的影响目的:磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-ohkinase,pi3k)和细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinase,erk)两个信号通路合称为再灌注损伤挽救激酶信号通路。两个途径均参与心脏缺血再灌注损伤的保护作用。pi3k/akt及erk均可以促进gsk-3β磷酸化,从而降低线粒体atp的消耗,减少ros的生成。hkii是糖酵解关键限速酶,可通过pi3k/akt信号通路调控,akt磷酸化可激活的hkii与线粒体结合,保护线粒体功能。我们研究发现hysa对缺血再灌注损伤具有保护作用,但在给于pi3k,erk,hkii抑制剂下其保护作用不同。本研究将考察hysa对细胞中pi3k,erk,hkii途径的影响。方法:本研究将通过建立h/rh9c2细胞,通过给于hysa及不同抑制剂,采用westernblot法分别检测细胞p-akt,p-gsk-3β,hkⅡ蛋白含量考察hysa对risk途径及hk途径的调控作用。结果:1与正常组相比较,h/r细胞模型组细胞胞浆中p-akt有所升高;给于模型细胞hsya后,细胞中p-akt含量显著升高,与模型组具有显著差异。同时给于pi3k抑制剂ly294002后,p-akt含量较明显降低,pi3k抑制剂ly294002明显降低了hysa对细胞p-akt的诱导作用。2与正常组相比较,h/r细胞模型组细胞胞浆中p-gsk-3β有所升高;给于模型细胞hysa后,细胞中gsk-3β含量有所升高,与模型组具有显著差异。但与其对akt的激活作用明显较弱,同时给于erk抑制剂PD98059后,GSK-3β含量明显降低,ERK抑制剂PD98059明显降低了HYSA对细胞p-GSK-3β的诱导作用。3与正常组相比较,H/R细胞模型组细胞中HKII显著降低;但给于模型细胞HYSA后,细胞中HKII含量显著升高,与模型组及空白组具有显著差异。同时给于HKII抑制剂3-BrPA后,HKII含量明显降低,HKII抑制剂3-BrPA明显降低了HSYA对细胞HKII的诱导作用。结论:1在H/R细胞模型中,HYSA对细胞具有明显保护作用并呈浓度依赖性。2 HYSA可显著降低细胞氧化应激水平,减少细胞中细胞色素C、caspase 3的水平和细胞凋亡,同时恢复线粒体能量代谢。3 PI3K抑制剂预处理(LY294002)或给于HKII抑制剂(3-BrPA),HYSA的保护作用明显减弱。相反,ERK抑制剂(PD98059)预处理,对HYSA的心肌细胞保护作用影响不显著。4 ERK通过磷酸化GSK3-β发挥心肌保护作用,但HYSA对GSK3-β磷酸化效果较弱。HYSA可以显著上调Akt和HKII。同时,给予HYSA及ERK抑制剂后,GSK3-β磷酸化水平明显减少和模型组无显著性差异。5本项研究表明HYSA的保护作用主要是通过PI3K/AKT/HKII途径。