肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是在世界上最常见的恶性肿瘤之一,世界各地每年有超过50万新增的HCC病人。在中国,乙型肝炎病毒(HBV)感染是最重要的致癌因素。在大多数人群的流行病学调查当中,发现男性HCC的发病率高于女性。男性HCC在最常见的恶性肿瘤排第五,女性排在第七,男女比例通常在2：1至4：1的范围内。与男性的HCC发病率比女性高的趋势一样,慢性肝病也存在这样的趋势。由HBV病毒感染所致的肝炎发展成肝癌在男性中比女性要快。然而在肝癌的治疗过程中,男性肝癌引起的死亡比女性多。无论是自发的或是切除后的生存率,女性肝癌患者都较男性高。鉴于肝细胞癌发病和预后显著的性别差异,体外以及体内的研究已在上世纪70年代已经开始去探索其产生的重要机制。近年来得到快速发展的蛋白质组学己成为重要的前沿研究领域。定量蛋白质组学采用大规模、高通量、高灵敏度的技术手段,能整体地观察疾病发生发展过程中蛋白质种类和数量的变化,为探讨疾病的发病机制以及寻找诊断的特异性标志物和药物治疗的靶标提供了一个新的平台。运用此研究策略,本研究通过对HBV背景下的男性和女性肝细胞癌组织的蛋白质表达差异分析,建立了HBV相关的肝细胞性肝癌男女发病性别差异的蛋白质数据库,并对一些有潜在应用价值的差异蛋白质在肝癌组织中进行mRNA水平和蛋白水平的验证。本部分工作的主要目的是对HBV相关的男性和女性肝细胞癌早期阶段的蛋白质组进行定量分析,筛选出肝细胞癌性别差异表达的蛋白质分子标志物。首先筛选手术切除的男性和女性早期肝癌组织,以及正常对照的肝脏组织共26例样本,进行iTRAQ标记和2D-LC-MS/MS定量蛋白质组学技术分析；分别用iTRAQ试剂113、114、115、116和117标记男性肝癌组1、男性肝癌组2、女性肝癌组、男性正常组和女性正常组。经过强阳离子柱和反相色谱柱分离后,进行质谱检测和SWISS-PROT数据库检索,一共鉴定出652个蛋白(95%可信度)。以质谱结果蛋白比值>1.2或<0.8为差异蛋白筛选标准,共鉴定出73个男女肝癌性别差异蛋白(113：115,114：115)和122个肝癌与正常组织差异的蛋白(113：116,114：116,115：117)。利用生物信息学对差异蛋白进行分析,这些差异蛋白主要定位于细胞质以及细胞器中,参与生物合成、代谢、生物调节和应激等生物学过程。信号通路分析中,多数差异蛋白参与了能量代谢的通路。以上结果表明,利用iTRAQ技术,本研究建立了肝癌男女性别差异蛋白质组的差异表达蛋白数据库,这些蛋白分子可作为潜在的分子标记物进行深入研究,有助于揭示男性肝癌高发潜在的分子机制。第二部分部分差异蛋白的表达验证本部分是对第一部分iTRAQ筛选出来的部分HBV相关肝癌的差异蛋白质数据进行表达验证,证实质谱结果的可靠性。并判断分析差异蛋白质分子在男女肝癌发生发展中起到的作用。在38例男性和14例女性肝癌组织标本以及4例男性正常肝脏组织和7例女性正常肝脏组织中,根据生物信息学分析结果,选取部分差异蛋白应用RT-PCR和Western-Blot免疫印迹实验对质谱结果进行验证,选用p-actin作为内参。结果显示,在mRNA水平上,筛选出的5个差异蛋白基因表达趋势与质谱结果一致；在蛋白水平上,其中的差异蛋白Y染色体编码睾丸特异性蛋白1(TSPY1)在男性肝癌组中较女性肝癌组表达升高,而在正常的男性和女性肝脏组织中表达无差异。通过依据组织中雄激素受体的表达情况,分析发现TSPY1的表达量随着雄激素受体升高而增高。结果表明在男性肝癌组、女性肝癌组、男性正常组和女性正常组中TSPY1的mRNA和蛋白水平的表达趋势与质谱鉴定结果均一致,TSPY1可能与雄激素及其受体途径相关,参与了男性肝癌的发生和发展。结论1.蛋白质组学技术可高通量筛选HBV相关的男性和女性肝癌中的差异表达蛋白,这些蛋白分子可作为潜在的分子标记物进行深入研究,有助于揭示男性肝癌高发潜在的分子机制。2.与HBV相关的女性肝细胞癌组织相比,男性的肝细胞癌组织表现出有一定差异性的蛋白表达谱,表明男性肝癌发生和发展是一个有着特殊差异因素参与的过程。共鉴定出的73个差异表达蛋白质,可能参与肝癌的发生和发展有关。3.HBV相关的肝细胞癌组织与正常肝脏组织相比,蛋白表达谱存在明显的差异性,表明肝癌的发生发展过程与多种差异蛋白相关。共鉴定出122个差异蛋白,其中一些分子可能与肝癌密切相关。4.初步探讨了TSPY1与男性肝细胞癌之间的联系,有助于肝细胞癌病理机制的阐明,它很有可能是导致HBV相关肝细胞癌男女性别差异的重要因子,为肝癌的诊断和治疗研究提供新的靶点。创新点应用蛋白质组学iTRAQ技术,首次筛选出73个HBV相关肝癌男女性别差异的蛋白质,其中TSPY1等蛋白在肝癌中差异表达为新报道。潜在应用价值1.筛选出的差异蛋白有可能成为肝癌的诊断标志物及预后判断指标,丰富肝癌诊疗指标的选择与组合。2.TSPYl可以作为一种潜在的、有应用价值的诊断肝癌、判断治疗及预后的分子标志物。