论文部分内容阅读
本试验通过参考其它植物同源基因的保守区序列设计引物，以桑树(育71-1)的扦插苗为试验材料，克隆了桑树CBF1转录因子基因、甜菜碱醛脱氢酶基因的cDNA全长序列，并对获得序列进行了分析、表达和功能验证等。研究内容及结果如下：1、桑树CBF1转录因子基因的克隆，表达分析及5’端启动子序列的克隆与分析本试验利用RT-PCR和RACE技术克隆了桑树CBF1基因的cDNA序列，命名为MCBF1，(GenBank登录号JX186750)。序列分析结果表明该基因序列全长为1134bp，包括693bp的开放阅读框(ORF)，87bp的5’UTR和354bp的3’UTR。生物信息学预测显示其演绎的氨基酸序列具有AP2结构域及其两端的CBF家族特有的多肽序列，与其它植物CBF基因翻译的氨基酸序列同源性较高。将构建的pET28a-MCBF1转化大肠杆菌BL21后，诱导表达的MCBF1重组蛋白分子量与预测大小基本一致。构建的系统进化树显示：桑树与柑橘（Citrusjambhiri）、垂枝桦（Betula pendula）和切花月季（Rosa hybrid cultivar）的亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析发现，MCBF1基因在未经过4℃处理的对照桑苗嫩叶中无表达，在4℃处理过的桑苗幼叶中均有表达，而在处理6天后相对表达量最高。通过染色体歩移法克隆了该基因起始密码子上游约400bp的碱基序列，并利用在线软件PLACE对其进行了分析。2、桑树甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的cDNA全长克隆及序列分析从桑树中克隆了甜菜碱醛脱氢酶基因的cDNA序列，命名为MBADH，(GenBank登录号KC244769)。序列分析结果表明桑树的BADH基因cDNA序列全长1883bp，可编码501个氨基酸，蛋白分子量为54.6KD，等电点pI为5.19。氨基酸序列分析显示，MBADH蛋白中具有与酶结合位点相关的十肽序列(VSLELGGKSP)，同源分析表明BADH基因在桑树与其它植物之间有很高的保守性。基于桑树和其他18个物种的该基因构建的系统进化树表明桑树与榛(Corylus heterophylla)亲缘关系较近，其次是茶树(Camellia sinensis)和人参(Panax ginseng)，而与其他物种亲缘关系较远。