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白血病是儿童和青少年常见的恶性肿瘤之一，鉴于白血病细胞的不局限性，其治疗方法受到很大的限制。抗肿瘤免疫反应主要是由细胞介导的，T细胞是主要的效应细胞。肿瘤抗原须经过抗原递呈细胞的加工、递呈才能有效激活T淋巴细胞。树突状细胞是专职的、最重要的抗原递呈细胞，在抗肿瘤免疫应答过程中发挥重要作用。GM-CSF能促进树突状细胞分化、成熟，刺激MHC分子和共刺激分子表达，并具有诱导粒细胞和巨噬细胞分化和调节免疫应答的作用。本研究采用分子克隆技术，构建小鼠GM-CSF（mGM-CSF）真核表达质粒pcDNA3-GM-CSF，并用电穿孔法将其导入白血病细胞系FBL-3，筛选鉴定后，用丝裂霉素灭活制备转GM-CSF基因瘤苗，初步探讨其作为瘤苗的有效性，并由此探索白血病免疫治疗的可行性。主要研究结果如下： 1．真核表达重组质粒pcDNA3-GM-CSF的构建 用PCR方法从PET-30a（+）-GM-CSF原核表达重组质粒扩增目的cDNA序列，并引入BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点。用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切PCR产物后装入pcDNA3空载质粒，构建了真核表达重组质粒pcDNA3-GM-CSF。酶切和测序结果与预期相符，无插入、丢失、突变，并且方向正确。 2．电穿孔法转染FBL-3细胞及GM-CSF高表达细胞克隆的筛选 用电穿孔法将pcDNA3-GM-CSF重组质粒转染入小鼠红白血病细胞系FBL-3细胞，经G418筛选和限制性稀释法克隆化后，获得G4 18抗性细胞克隆。经G4!8筛选、PCR和RT一PCR鉴定，证明GM一CsF基因整合到了受体细胞染色体中并稳定表达。应用RT一PCR、骨髓造血祖细胞增殖实验和骨髓造血祖细胞集落刺激实验筛选出了相对高表达GM一csF的细胞克隆FBL一3一GM一CSF（克隆3）。3.FBL一3一GM一CSF细胞生物学特性 FBL一3一GM一CSF细胞体外生物学特性与FBL一3一vect和FBL一3细胞相比没有明显差异，它们的细胞形态间无差别，生长速度亦相似。体内致瘤性实验中，各组肿瘤均持续生长，但同一接种数量间相比，FBL一3一GM一CSF平均出瘤时间比FBL一3一vect和FBL一3晚，肿块平均体积也相应较小，生存期略有延长，但均无显著性差异。4.丝裂霉素灭活FBL一3一GM一CSF后作为瘤苗的有效性和白血病免疫治疗的可行性 丝裂霉素灭活FBI二一3一GM一CSF后作为瘤苗，免疫小鼠产生的免疫保护力，明显强于FBL一3一vect和FBL一3。FBL一3一GM一CSF组与FBL一3一vect、亲本FBL一3肿瘤细胞和PBS对照组相比出瘤时间晚、肿瘤生长速度慢、小鼠生存期延长，其中有4/10的小鼠长期存活（超过60天）。另外，转基因瘤苗免疫治疗动物实验结果也显示:与FBL一3一vect、亲本FBL一3肿瘤细胞和PBS对照组相比FBL一3一GM一CSF组肿瘤生长速度受到明显抑制，其中2只小鼠肿瘤完全消失;小鼠生存期延长，其中有2/10的小鼠长期存活（超过60天）o 以上研究结果显示出丝裂霉素灭活FB卜3一GM一csF后作为瘤苗的有效性和白血病免疫治疗的可行性。为进一步的临床研究和应用打下了基础。