研究背景：肺癌是严重威胁人类健康的疾病，据报道，肺癌高居2009年美国肿瘤死因榜首，而近年来，肺癌发病率、死亡率在中国等发展中国家也持续飙升，就中国广州的肺癌死亡率来看，1970-1972年为11.61/105，而后上升到1980-1982年32.67/105，1990-1992年41.54/105，2000-2002年48.79/105，这些触目惊心的数字迫使研究者们积极地探讨肺癌病因。研究发现，在罹患肺癌的人群中，80％归因于烟草暴露；但吸烟人群中仅10％的人最后发展为肺癌，表明肺癌的形成尽管与环境因素有关，但还取决于个体的遗传易感性。为了分析肺癌的遗传易感因素，当前很多学者致力于分子水平的实验研究，但仍有许多问题有待进一步阐明。　　 miRNA是生物体内一类非编码的小分子RNA，在细胞内经历了从初始miRNA（pri-miRNA）剪切为前体miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA再加工为长度约22个碱基的miRNA成熟体的过程。miRNA成熟体主要通过与靶基因3’UTR和5’UTR互补结合来调控靶基因的表达，且研究发现miRNA参与了细胞的癌变过程，例如有报道称人肺癌细胞株中has-mir-182结合RGS17基因的3’UTR的两个保守位点来对RGS17基因进行调控。又如，has-mir-21的调控功能异常是已知的与许多种癌症发病相关的因素，最近有研究认为，在非小细胞肺癌细胞株中，has-mir-21通过结合抑癌基因PTEN的3’UTR来下调PTEN蛋白的表达。再如，有研究以非小细胞肺癌组织为材料，得出K-ras基因的3’UTR上let-7的第6个结合区域（let-7 complementary sites 6,LCS6）的第4个碱基上存在突变（随后通过46个人群实验证明该突变的频率为5.8％，即为单核苷多态，常缩写为SNP）时，let-7与靶点的结合会出现异常，则有增加个体发生非小细胞肺癌遗传易感性的可能性；他们进而检测美国新墨西哥和波士顿地区两个人群中该SNP在病例和对照中的频率分布，发现该SNP与两个适度吸烟人群的非小细胞肺癌发病有关。此外还有很多实验表明靶基因mRNA的3’UTR上出现SNP时会影响癌症的发病风险。　　 miRNA序列上存在SNP时，是否会影响癌症的患病风险，以及miRNA序列上的SNP如何影响癌症的发生，已成为了当今肿瘤分子流行病学领域的一个新课题。有学者系统地扫描了人癌组织和肿瘤细胞株的几百个miRNA的序列,得出一系列的突变位点；后续的细胞试验证实，let-7e前体存在G>A突变（记成熟体5’端下游为+，上游则为-,成熟体miRNA5’端第一个碱基为+1；该突变位点位前体下游的第19个碱基，记作+91）会导致其成熟体表达量显著下降，进一步发现该突变影响了let-7e从pre-miRNA加工为miRNA成熟体的过程，从而与癌症的发生相关。美国研究人员测定80名患家族遗传性卵巢癌病人的30个候选miRNA的序列，发现了包括has-mir-191前体上的C>A（位置记作+24）变异在内的7个突变位点，经软件预测得出has-mir-191上的突变会使其二级结构变得不稳定，且与靶点结合的最大自由能也发生了改变；后通过实验证实has-mir-191突变后，其成熟体的表达量降低；进一步检测携带该位点突变基因型的患者的12名亲属的基因型，其中有4名携带CA基因型，8名为CC基因型，而4名CA基因型携带者中有2名随后也被诊断患有卵巢癌，另外8名不携带突变基因型的家属则未检出卵巢癌疾患；最后推论has-mir-191前体上的C>A变异会影响其调控抑癌基因或癌基因的功能，与卵巢癌的遗传易感性具有潜在的关联。　　 经搜索生物信息数据库发现，中国人群中有4个满足较小的等位基因频率（MAF）大于0.05的SNP位于miRNA成熟体上，分别是：has-miR-499-3p，has-miR-608，has-miR-196a2，has-miR-146a，其中has-miR-499-3p上的SNP位于种子序列上。生物信息学预测还显示，has-miR-499-3p与我们承担国家自然科学基金项目所研究的DNA损伤修复基因NBS1之3’UTR存在互补配对关系。综上所述，本研究拟探讨has-miR-499-3p种子序列的遗传变异（rs3746444 A>G）与中国南方人群肺癌发病的关系。　　 研究目的：　　 拟研究has-miR-499-3p种子序列rs3746444位点A>G的遗传变异与中国南方人群肺癌发病的关联性，再综合相关研究报道讨论该位点与癌症的发病风险；通过生物信息学的预测来解释miRNA种子序列上存在碱基突变时增加癌症发病风险的原因；为相关人群提供肺癌预防、诊断及治疗的生物标志物，并为其他癌症的研究提供借鉴。　　 研究方法：　　 （1）采取病例-对照模型，首先收集广州市及周边城市的526例原发性肺癌患者，并从10，000名健康社区居民中随机选取526例与肺癌病例性别相同、年龄相差±1岁、无血缘关系的正常对照；结合已有的文献资料,通过生物信息学分析选择适宜的SNP位点；采用PCR-RFLP技术检测肺癌人群和对照人群的has-miR-499-3p种子序列的rs3746444位点的基因型；用SAS 9.13统计软件分析人群的人口学特征、筛选出危险因素、将单因素和基因型进行非条件Logistic回归，校正混杂因素的影响，分析基因变异与肺癌发病的关联及“基因-环境”的交互作用。　　 （2）综合与rs3746444位点遗传变异相关的癌症研究报道进行meta分析，通过合并的效应量来评价该遗传变异与癌症的关联性。　　 （3）试图通过生物信息学的预测来解释miRNA种子序列上存在rs3746444 A>G变异时增加癌症发病风险的原因。　　 研究结果：　　 （1）本研究按病理类型分类，526例肺癌中腺癌195例（37.1％），鳞癌180例（34.2％），大细胞肺癌21例（4.0％），小细胞肺癌65例（12.4％），其他如腺鳞癌、混合型肺癌等计65例（12.4％）；按病理分期有I期73例（13.9％），II期50例（9.5％），III期173例（32.9％），IV期230例（43.7％）。比较对照组和病例组，年龄和性别均无统计差异（分别为P=0.084和P=0.322）、吸烟情况也有差异（P=0.014），但饮酒者在正常人和患者间的分布无明显差异（P=0.178），家族癌症史在两组间有明显差异（P=0.174）。Has-miR-499-3p种子序列的rs3746444变异位点（A>G）存在三种基因型（AA、AG、GG），它们在肺癌病例组与对照组中的分布差异具有显著性（P<0.0001）；以携带野生型纯合子AA基因型为参照，携带AG基因型个体发生肺癌的危险度可增加32％（校正OR=1.32,95％CI=1.01-1.81），携带GG基因型的个体患肺癌的危险度更显著地增加了122％（OR=2.22,95％CI=1.52-3.23）；且rs3746444 G 变异allele的个数与肺癌发病危险存在显著的剂量反应关系（P-trend=3.04×10-5）；分层分析显示，携带rs3746444 G 变异基因型的（AG+GG）个体发生肺癌的危险性在年龄>60岁（OR=2.36,95％CI=1.60-3.49）；女性（OR=2.49，95％CI=1.51-4.12）；不吸烟（OR=2.12，95％CI=1.43-3.15）；不饮酒（OR=1.73，95％CI=1.28-2.34）；以及三代以内直系亲属有癌症患病史（OR=1.57，95％CI=1.19-2.07）的人群中更为显著，说明rs3746444 G变异可能是一个与肺癌发病有关的遗传标志。　　 （2）经检索共收集到五个报告rs3746444位点变异与癌症关联性的研究，经meta综合分析的效应，结果表明该位点的变异[AG+GG vs.AA]可增加发生癌症的风险（OR=1.15，95％CI=1.05-1.26，P=0.002）。　　 （3）生物信息学预测，发现抑癌基因ADAMTS9可能是has-miR-499-3p的靶基因之一，当has-miR-499-3p在rs3746444位点为G allele时，它与ADAMTS9结合的最大自由能mfe-31.1 千卡/摩尔，较rs3746444位点为A allele时它与ADAMTS9结合的最大自由能mfe-26.4千卡/摩尔更小，表明其结合稳定，可能使得ADAMTS9更易发生降解。进一步的信息学分析还发现，乳腺癌中ADAMTS9蛋白表达显著低于癌旁组织；肺细胞系经石棉染毒可导致其ADAMTS9基因表达下降；这些变化是否与has-miR-499-3p的rs3746444 A>G有关，值得深入探讨。　　 研究结论：has-mir-499-3p种子序列（rs3746444 A>G）遗传变异可增加人群发生肺癌的危险性，将为肺癌人群防治提供生物标志物。