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研究目的:随着我国人口老龄化的加剧,延缓衰老成为医学工作者的重要任务,特别是对脑功能减退的改善是延缓衰老的重要研究方向。本课题通过D-半乳糖注射建立小鼠衰老模型,探讨艾炷灸延缓脑衰老的作用机制。方法:先后两批次用Morris水迷宫筛选三月龄体重30±2克的健康雄性小鼠72只。编号后,分为六组进行水迷宫实验。实验造模时,按随机区组设计将72只小鼠分为:生理组盐水组(简称生理组)、造模组、艾炷灸足三里、悬钟穴组(简称艾灸1组)、艾炷灸关元、百会穴组(简称艾灸2组)、电针足三里、悬钟穴组(简称电针组)、尼莫地平灌胃组(简称尼莫地平组)六组。造模组和各干预治疗组以D半乳糖按120mg/kg/d颈背部皮下注射,连续42天,同时生理组颈背部皮下注射等量的生理盐水42天。造模第13天开始艾柱灸、电针、尼莫地平灌胃治疗,隔天一次,各组共15次。生理组和造模组不做任何治疗性干预,但给予与各治疗组同样时间、同等程度的捉抓,造模、治疗结束后,再次行迷宫行为学检测后断头处死,取脑固定,或脑组织匀浆。另取6只18月龄自然衰老小鼠与模型组做组织形态学比较。主要观察指标有:(1)电脑采集各组小鼠造模治疗前后Morris水迷宫行为学指标,包括定位航行实验的指标:“潜伏期”、“寻求次数”、“停留时间”、“平台象限百分比(简称平台象比)”和空间探索实验指标:“原平台象限百分比(简称原象比)”、“跨台次数”;(2)各组小鼠造模治疗后大脑组织光镜下病理形态学变化、神经元密度;(3)各组小鼠造模治疗后大脑皮质电镜下超微结构变化;(4)各组小鼠造模治疗后大脑组织NO含量变化;(5)各组小鼠造模治疗后大脑组织TNOS、iNOS活力变化;(6)各组小鼠造模治疗后大脑组织总SOD、CuZnSOD活力变化;(7)各组小鼠造模治疗后大脑皮质c-fos的表达;(8)各组小鼠造模治疗后大脑皮质p16的表达;(9)各组小鼠造模治疗后大脑皮质Rb的表达;(10)各组小鼠造模治疗后大脑皮质、海马CA3区原位杂交c-fosmRNA的表达。结果:(1)造模、治疗前六组小鼠的学习记忆能力一致,无差别。实验后,①造模组与其他五组相比,“潜伏期、寻求次数、停留时间、平台象比、跨越次数、原象比”六项指标均差异有显著性意义(P＜0.01或P＜0.05),模型组“潜伏期”较生理组、艾灸1、2组、电针组、尼莫地平组延长,模型组“寻求次数、停留时间、象比、跨越次数、原象比、平台象比”较其他各组缩短、降低,②其他五组,尼莫地平组与生理组比较在潜伏期、平台象比差异有显著性意义(P＜0.05),电针组、艾灸2组在潜伏期与生理组比较差异有显著性意义(P＜0.05)。其余各项指标在五组间无差异。提示D-半乳糖造成亚急性衰老小鼠脑功能受损,学习记忆能力下降。艾炷灸、电针干预组小鼠的学习记忆能力与生理组的学习记忆能力相似,尼莫地平组学习记忆能力与生理组差异有显著性意义(P＜0.05),但与其他三个治疗组无差异。(2)光镜下大脑组织切片苏木伊红染色:①生理组大脑皮层细胞结构正常,胞核紫蓝色清晰,胞浆丰富呈浅紫蓝色,间质无水肿表现,海马CA3区锥体细胞2～3层,排列紧密,细胞核圆而大,核呈,核仁清晰。②模型组、自然衰老组可见皮层变薄,大部分神经元变性,体积变小,胞核与胞浆界限模糊,呈蓝黑色,核固缩成三角形或不规则形,核仁消失。海马CA3区锥体细胞层数减少,排列稀疏、不规则,细胞体积变小,可见核固缩现象。③艾灸1、2组、电针组和尼莫地平组组仍有不同程度的神经细胞变性,但变性神经细胞数量显著减少,零星可见部分损伤细胞,海马CA3区锥体细胞层细胞形态、排列基本正常。④各组小鼠脑皮质及海马CA3区神经元密度差异有显著性意义(P＜0.01),组间比较,生理组、_艾灸1、2组、电针组、尼莫地平组与模型组、自然衰老组神经元密度比较差异有显著性意义(P＜0.01),模型组神经元细胞密度下降。自然衰老小鼠大脑皮质神经元密度与模型组无差异,但在海马CA3区自然衰老组神经元密度较模型组减少明显(P＜0.05)。生理组、艾灸1、2组、电针组之间神经元密度无差异,尼莫地平组与前四组比较在皮质区神经元密度差异有显著性意义(P＜0.01或P＜0.05),在海马区仅与生理组神经元密度差异有显著性意义(P＜0.05)。(3)电镜下:①生理组组织结构较好,神经细胞结构清晰,细胞为锥体形或多边形,胞浆较宽,细胞器丰富,可见较多的线粒体、粗面内质网、高尔基体、核糖体等,核染色质疏松,核仁清楚及少量吞噬溶酶体。未见明显水肿等其他变化。轴索结构清楚,微丝微管丰富,排列整齐。②造模组神经细胞有变性,变性细胞程度不一,少数神经细胞轻度变性,但普遍程度较重。线粒体数量增多、增大或空泡变性,线粒体脊模糊,核糖体脱落。轴索肿胀空泡化,微丝微管数量减少,排列散乱。部分髓鞘结构松解或脱失,出现较多的吞噬溶酶体(脂褐素)。部分小血管内皮细胞有变性,血管周隙扩大,星形细胞空泡变性或溶酶体增多,足突破坏较明显。③其它各干预治疗组依病变程度从重到轻排序:尼莫地平组,艾灸2组,电针组和艾灸1组。(4)六组小鼠的大脑组织NO含量差异有显著性意义(p＜0.01),两两比较:模型组的大脑组织NO含量较其他五组显著升高(p＜0.01),其他五组间脑组织NO含量比较无明显差异。(5)六组小鼠的大脑组织总NOS(TNOS)活力和诱导型(iNOS)活力具有显著性差异(p＜0.01),两两比较:模型组的脑组织TNOS、iNOS活力较其他五组显著升高(p＜0.01),其他五组脑组织TNOS、iNOS活力比较无明显差异。(6)六组小鼠的大脑组织总SOD活力和铜锌SOD(CuZnSOD)活力具有显著性差异(p＜0.01),两两比较:模型组脑组织总SOD活力和CuZnSOD活力较其他五组显著降低(p＜0.01),其他五组脑组织总SOD活力无明显差异;尼莫地平组、电针组脑组织CuZnSOD活力与艾灸2组比较差异有显著性意义(p＜0.01,p＜0.05),尼莫地平组CuZnSOD活力与艾灸1组比较差异有显著性意义(p＜0.05),其他各组间比较无差异。(7)各组大脑皮质均有c-fos、p16、磷酸化Rb(pRb)的蛋白表达,模型组c-fos、pRb蛋白表达细胞较少、染色浅,生理组、艾炷灸、电针、尼莫地平灌胃治疗组c-fos、pRb蛋白表达细胞较多、染色较深。模型组p16蛋白表达细胞较较多、染色较深,生理组、艾炷灸、电针、尼莫地平组p16蛋白表达细胞较少、染色较浅。各组c-fos、p16、pRb的蛋白表达差异有显著性意义(p＜0.01)。组间比较:造模组c-fos、pRb蛋白阳性表达神经元密度较其他五组降低(p＜0.01),造模组p16蛋白表达神经元密度较其他五组升高(p＜0.01)。尼莫地平组c-fos阳性表达神经元密度与生理组、艾灸1组比较差别均具有显著性意义(p＜0.01,p＜0.05)。其余指标在五组间无差异。(8)各组大脑皮质、海马CA3区均有c-fosmRNA的表达,模型组c-fosmRNA的表达细胞排列松散、染色浅,生理组和各治疗组c-fosmRNA的表达细胞较紧密、染色较深,各组c-fosmRNA的蛋白表达差异有显著性意义(p＜0.01)。组间比较:造模组大脑皮质、海马CA3区c-fosmRNA阳性表达神经元密度较其他组降低(p＜0.01,p＜0.05),其他五组在大脑皮质c-fosmRNA阳性表达神经元密度无差别;尼莫地平组海马CA3区c-fosmRNA阳性神经元表达密度与艾灸1组比较差别具有显著性意义(p＜0.05)。其余4组间海马CA3区c-fosmRNA阳性神经元表达密度无差异。结论:(1)艾炷灸干预疗法能较好改善D-半乳糖衰老小鼠学习记忆能力。(2)艾炷灸干预疗法能较好保护D-半乳糖衰老小鼠大脑皮质组织形态及超微结构,减轻氧化损伤,保护神经元细胞。(3)艾炷灸干预疗法能较好抵抗衰老脑组织自由基氧化损伤,增强脑组织的抗氧化能力。(4)艾炷灸干预疗法能促进学习记忆相关脑区大脑皮质、海马CA3区即刻早期基因c-fos、c-fosmRNA的表达。(5)艾炷灸干预疗法能影响细胞周期调控基因:抑制大脑皮质神经元细胞中与衰老相关基因P16的表达,而促进与P16呈负相关的磷酸化Rb基因的表达,进而也促进了大脑皮质c-fos、c-fosmRNA的表达。