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跨界原生质体融合(IKPF)构建基因工程菌Fhhh-GEMs，降解精对苯二甲酸(PTA)石油化工废水过程中锰过氧化物酶(MnP)表达和降解动力学，是本研究的主要内容，属于国家863高技术发展课题[2001AA214191]。[IKPF：Inter-KingdomProtoplastFusion，Fhhh：FusantwithHigh-degradability、High-flocculation、Highadaptability，GEMs：GeneticallyEngineeredMicroorganismstrain，PTA：PurifiedTerephthalicAcid；MnP：manganeseperoxidase]。
原生质体融合PF(ProtoplastFusion)凭借较高的基因重组频率、消除遗传障碍的性能、不产生新的基因污染、具有生物安全性等优势，广泛应用于医药、食品、果树、蔬菜、粮食等方面微生物与植物品种的改良。PF技术于20世纪80年代定义为一种基因工程。通过将两种及两种以上物种的基因与原生质，在一个细胞内进行重组整合，创造出新的物种。创造出的微生物新菌株可称为基因工程菌GEMs。1973年，化学促融剂PEG的发现与应用，使得PF技术发展进入一个高峰阶段。美国应用PF研究植物品种改良居世界前列。中国研究PF水平处于国际前沿。
尽管自1973年以来国际上已发表原生质体融合的技术专利达1000项以上，但尚没有用于废水处理的技术专利。本研究原创跨界原生质体融合技术，将三亲株微生物中的真菌真核细胞与细菌原核细胞，经过两次跨真核原核两界细胞的原生质体融合，构建出Fhhh基因工程菌，用于处理PTA石油化工废水。研究发现及主要成果有以下3个方面：
1.跨界融合构建与鉴定Fhhh-GEMs基因工程菌
(1)Fhhh-GEMs由黄孢原毛平革真菌PC、土著细菌YZ1、酿酒酵母真菌SC三个菌株，经过真核原核两细胞的两次融合获得。三亲株跨界融合是本研究原创技术。
(2)DNA-PCR分子遗传学测定表明，Fhhh-GEMs含有来自亲株PC降解性目标基因mnp和lip，其具有分子遗传稳定性达700代以上，从而为处理PTA废水提供了重要依掘。
(3)Fhhh-GEMs能在同时含有抗真菌和抗细菌两类抗生素的培养基中生长，而三亲株中的任一菌株，只能在一类抗生素培养基中生长。双抗生化特征便于筛选与鉴定。
(4)Fhhh-GEMs细胞形态不同与任一亲株。电子扫描显微镜(SEM)摄像结果表明，Fhhh细胞形状呈近小球体，细胞体积介于三亲株之间。
2.Fhhh-GEMs降解性目标基因MnP酶学表达
(1)在C、N、P营养元素充足的条件下，0.003mg/L的Mn2+即可满足Fhhh-GEMs和PC降解性目标基因mnp表达MnP至最高水平的需要，不同于其它报道。
(2)Fhhh-GEMs降解PTA废水主要依靠其合成的MnP和LiP两种胞外过氧化物酶，添加Mn2+会延迟LiP表达，高浓度的氮和锰离子浓度会抑制LiP酶的合成。
(3)Fhhh-GEMs降解PTA废水过程中，MnP和LiP的水平峰值处于不同时段，因为两者降解的目标底物不同。这一发现为在合理时段利用降解功能，提供重要依据。
(4)Fhhh-GEMs降解PTA废水主要依靠MnP表达。其最适条件是：接种量1/10(V/V)、温度25-35℃、pH5.0-7.0、Mn2+10-50mg/L、TN/TP为50/10-100/20mg/L。
3.Fhhh-GEMs降解PTA废水动力学与Ebis软件计算
(1)Fhhh-GEMs降解PTA废水动力学研究采用极大似然法。以Monod和Andrews方程为基础，通过积分变换，建立非线性回归数学模型，推算出动力学参数值。
(2)Andrews非线性模型较Monod非线性模型更为理想。Andrews能确证在好氧降解PTA废水过程中的底物自身抑制作用，而Monod方程却无法反映这种现象。
(3)废水起始COD(So)/起始生物量(Xo)，影响Fhhh-GEMs最大比增长率Umax和最大比降解率qmax。当So/Xo=4.695时，Umax=0.0126h-1，qmax=0.09094h-1。
(4)坏境生物技术信息学软件Ebis，是本课题组所研制的具有国家著作权的信息软件。Ebis计算结果表明，Fhhh-GEMs在PTA废水中的比降解率q=0.0312h-1，是最大比降解率qmax的34％。与国际前沿报道的数据，具有可比性和应用开发前景。
综上所述：跨界原生质体融合原创技术，构建出的Fhhh-GEMs，具有分子遗传稳定性、双抗生化特征、SEM形态特征。其降解PTA废水性能主要与MnP表达水平相关，需要Mn2+参加及其它优化条件。非线性回归数学模型能够较好的反映Fhhh-GEMs降解PTA废水动力学关系。信息软件Ebis的计算结果与动力学的计算结果相容，Fhhh-GEMs降解PTA废水性能参数q的水平有国际可比性，具有开发应用前景。