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海洋蕴含具有复杂多样生理代谢特征的微生物资源，其具有极为重要的生态意义和巨大的应用潜力。然而受分离培养方法的限制，90％的海洋微生物无法获得培养。高通量极限稀释培养法可提高海洋微生物的可培养性，获得更具多样性及代表性的海洋微生物菌株资源，以深入研究其生理特性及生态作用。
近年来，青岛附近海域浒苔时常爆发，造成生态灾害，但浒苔生长迅速，也是一种丰富的海洋生物质资源。挖掘浒苔纤维素降解酶类，开发新型藻类工具酶，以高效降解浒苔纤维素，从而实现对浒苔生物质资源开发利用，同时缓解近海环境压力。
本文首先以青岛近海表层海水为样品，通过高通量极限稀释法分离海洋细菌菌株，进行多样性分析，并选取分离得到的其中两株细菌进行多相分类学研究。其次，根据浒苔降解细菌菌株的基因组测序结果，挖掘纤维素酶基因，通过异源表达，分离纯化和酶活测定，确定其对浒苔纤维素的降解能力。本文具体研究结果如下:
1.利用高通量极限稀释培养方法分离海洋细菌
利用高通量极限稀释培养法，自青岛太平角、田横岛和鳌山湾三个位点的表层海水样品中共分离得到111株细菌菌株并通过测定分析了分离菌株的16SrRNA基因序列。分析发现分离菌株中γ-变形菌占71.17％，α-变形菌占25.23％;它们属于22个属和两个类群，其中优势属为Pseudoalteromonas属(占48.65％)。其中可能代表细菌新分类单元的细菌共12株，占总分离细菌菌株的10.8％;有4株细菌属于寡营养类型菌株，其中三株属于SAR92类群，一株属于OM43类群。
从利用高通量极限稀释法从青岛近海表层海水中分离得到的菌株中，选择两株菌株，即菌株SM1969T和SM1979T，采用多相分类学的研究方法对其进行了分类鉴定。
菌株SM1969T和SM1979T细胞呈卵圆形，无鞭毛，可运动的革兰氏阴性细菌。菌株SM1969T在10-37℃(最适为25-30℃)、pH6.5-10.0(最适为6.5-7.0)和NaCl浓度1-6.5％(w/v)(最适为2.5％)的条件下生长。菌株SM1979T在15-37℃(最适为25-30℃)、pH6.0-10.0(最适为pH7.0)和NaCl浓度1-6％(w/v)(最适为3％)的条件下生长。菌株SM1969T和SM1979T所含极性脂为磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)，一种氨基脂(AL)和未鉴定结构的脂类(L);两者主要的脂肪酸组分均为summedfeature8(C18∶1ω7cand/orC18∶1ω6c)，呼吸醌均为泛醌Q-10。菌株SM1969T和SM1979T的基因组DNAG+C含量分别为56.4mol％和57.5mol％。在基于单拷贝同源蛋白序列的系统进化树中，菌株SM1969T和SM1979T与Tritonibacter属内的已知种相聚成簇，两者与Tritonibacterulvae一起形成独立分支。基于以上对菌株SM1969T和SM1979T的形态学特征，化学分类特征和基因组特征研究及系统进化分析，菌株SM1969T和SM1979T代表Tritonibacter属的两个新种，命名为Tritonibacteraquimarissp.nov.和Tritonibacterlitoralissp.nov.，其模式菌株分别为菌株SM1969T(=MCCC1K04320T=KCTC72843T)和菌株SM1979T(=MCCC1K04321T=KCTC72842T)。
2.浒苔纤维素降酶的挖掘
自Alteromonassp.HT-1、Photobacteriumsp.HT-2和Echinicolasp.HT-3基因组数据中挖掘获得12个可能的纤维素酶基因，对其进行异源表达和分离纯化。分别以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、微晶纤维素(Avicel)和对硝基苯基-β-D-葡糖苷(pNPG)作为底物进行酶活测定，发现酶蛋白1-4、1-5、3-1、3-8和3-9为内切葡聚糖酶，酶蛋白1-2和1-3为外切葡聚糖酶，酶蛋白2-1、3-2、3-3、3-5和3-6为β-葡糖苷酶。以浒苔纤维素为底物，发现内切葡聚糖酶1-4、1-5、3-1、3-8、3-9和外切葡聚糖酶1-2、1-3对其具有降解能力，且酶蛋白3-8的酶活最高。
近年来，青岛附近海域浒苔时常爆发，造成生态灾害，但浒苔生长迅速，也是一种丰富的海洋生物质资源。挖掘浒苔纤维素降解酶类，开发新型藻类工具酶，以高效降解浒苔纤维素，从而实现对浒苔生物质资源开发利用，同时缓解近海环境压力。
本文首先以青岛近海表层海水为样品，通过高通量极限稀释法分离海洋细菌菌株，进行多样性分析，并选取分离得到的其中两株细菌进行多相分类学研究。其次，根据浒苔降解细菌菌株的基因组测序结果，挖掘纤维素酶基因，通过异源表达，分离纯化和酶活测定，确定其对浒苔纤维素的降解能力。本文具体研究结果如下:
1.利用高通量极限稀释培养方法分离海洋细菌
利用高通量极限稀释培养法，自青岛太平角、田横岛和鳌山湾三个位点的表层海水样品中共分离得到111株细菌菌株并通过测定分析了分离菌株的16SrRNA基因序列。分析发现分离菌株中γ-变形菌占71.17％，α-变形菌占25.23％;它们属于22个属和两个类群，其中优势属为Pseudoalteromonas属(占48.65％)。其中可能代表细菌新分类单元的细菌共12株，占总分离细菌菌株的10.8％;有4株细菌属于寡营养类型菌株，其中三株属于SAR92类群，一株属于OM43类群。
从利用高通量极限稀释法从青岛近海表层海水中分离得到的菌株中，选择两株菌株，即菌株SM1969T和SM1979T，采用多相分类学的研究方法对其进行了分类鉴定。
菌株SM1969T和SM1979T细胞呈卵圆形，无鞭毛，可运动的革兰氏阴性细菌。菌株SM1969T在10-37℃(最适为25-30℃)、pH6.5-10.0(最适为6.5-7.0)和NaCl浓度1-6.5％(w/v)(最适为2.5％)的条件下生长。菌株SM1979T在15-37℃(最适为25-30℃)、pH6.0-10.0(最适为pH7.0)和NaCl浓度1-6％(w/v)(最适为3％)的条件下生长。菌株SM1969T和SM1979T所含极性脂为磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)，一种氨基脂(AL)和未鉴定结构的脂类(L);两者主要的脂肪酸组分均为summedfeature8(C18∶1ω7cand/orC18∶1ω6c)，呼吸醌均为泛醌Q-10。菌株SM1969T和SM1979T的基因组DNAG+C含量分别为56.4mol％和57.5mol％。在基于单拷贝同源蛋白序列的系统进化树中，菌株SM1969T和SM1979T与Tritonibacter属内的已知种相聚成簇，两者与Tritonibacterulvae一起形成独立分支。基于以上对菌株SM1969T和SM1979T的形态学特征，化学分类特征和基因组特征研究及系统进化分析，菌株SM1969T和SM1979T代表Tritonibacter属的两个新种，命名为Tritonibacteraquimarissp.nov.和Tritonibacterlitoralissp.nov.，其模式菌株分别为菌株SM1969T(=MCCC1K04320T=KCTC72843T)和菌株SM1979T(=MCCC1K04321T=KCTC72842T)。
2.浒苔纤维素降酶的挖掘
自Alteromonassp.HT-1、Photobacteriumsp.HT-2和Echinicolasp.HT-3基因组数据中挖掘获得12个可能的纤维素酶基因，对其进行异源表达和分离纯化。分别以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、微晶纤维素(Avicel)和对硝基苯基-β-D-葡糖苷(pNPG)作为底物进行酶活测定，发现酶蛋白1-4、1-5、3-1、3-8和3-9为内切葡聚糖酶，酶蛋白1-2和1-3为外切葡聚糖酶，酶蛋白2-1、3-2、3-3、3-5和3-6为β-葡糖苷酶。以浒苔纤维素为底物，发现内切葡聚糖酶1-4、1-5、3-1、3-8、3-9和外切葡聚糖酶1-2、1-3对其具有降解能力，且酶蛋白3-8的酶活最高。