慢性肺动脉高压大鼠循环血小板和白细胞的活化及HMG-CoA还原酶抑制剂干预的影响

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【背景和目的】原发性肺动脉高压(Primary Pulmonary Hypertension,PPH)是一种恶性进展性肺血管疾病,其基本病理特征是肺动脉内皮受损、血管重构和原位血栓形成。循环血小板激活是血栓形成的核心环节,但关于PPH时循环血小板活化的状态和作用尚无定论。PPH伴随有炎症的过程,并且研究表明血小板和白细胞可以形成聚集体(Platelet Leukocyte Aggregates,PLAs),该聚集体的形成是血小板激活的重要标志,也是血小板和白细胞相互作用的重要方式,而目前亦不明确PPH时PLAs的变化。近来研究提示p38 MAPK在血小板激活中有重要作用,但该通路在肺动脉高压时是否发生变化及其在相应血小板激活中的作用尚不清楚。大量的文献证实3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂(他汀类)具有不依赖于其调脂疗效的“多效性作用”,包括改善内皮功能、抗调亡、抗氧化、抑制炎性因子产生和抗血小板作用等。已有研究报道,他汀类药物可以降低实验性肺高压模型动物的肺动脉压,但具体机制不甚明了。本研究的目的是利用野百合碱(monocrotaline,MCT)诱发的慢性肺动脉高压(MCT induced pulmonary artery hypertension,MCT-PAH)大鼠模型,采用全血流式细胞术,观测慢性肺动脉高压时是否存在循环血小板、白细胞的活化和PLAs形成的增加及它们的相互作用,并探讨可能相关的信号通路;同时结合有创血流动力学、超声心动图、病理学等方法,评价水溶性HMG-CoA还原酶抑制剂阿托伐他汀和脂溶性HMG-CoA还原酶抑制剂普伐他汀对MCT-PAH大鼠的生存率、肺动脉压力及血小板、白细胞功能的影响,并比较不同剂量的阿托伐他汀的作用异同,为他汀类药物应用于PPH的临床治疗提供实验和理论依据。【实验方法】采用MCT 60mg/kg剂量皮下注射,诱导大鼠慢性肺动脉高压模型。于注射后3周末以右心测压导管测量右心室收缩压(RVSP)、肺动脉平均压(mPAP)的变化,以证明建立模型的可靠性。随机分为MCT 3周模型未治疗组(MCT3W组)16只,MCT 7周模型未治疗组(MCT7W组)32只,MCT7周模型+大剂量阿托伐他汀组(50mg/kg/d,MCT+A50组)20只,MCT 7周模型+小剂量阿托伐他汀组(10mg/kg/d,MCT+A10组)20只,MCT 7周模型+普伐他汀组(10mg/kg/d,MCT+P10组)20只。MCT+A50组、MCTA10组和MCTP10组均于MCT注射后第3周末开始,胃管管饲相应药物,共给药4周。另随机抽取16只雄性SD大鼠作为正常对照组。大鼠分别于MCT注射造模后3周末、7周末行超声心动图检测相关指标,并与正常对照组比较。于超声检测后第2天以有创血流动力学方法测定RVSP、mPAP,并与正常对照组比较。以全血流式细胞术测定基础状态及刺激剂作用下血小板纤维蛋白原的结合、白细胞CD11b的表达和血小板-白细胞聚集体的形成。以Western blot法测定血小板p38、磷酸化p38蛋白的表达。以右室游离壁重量除以左室(包括室间隔)重量,判断右心室的肥厚程度。病理切片作HE染色和Masson三色染色观测小肺动脉的中膜厚度。实验全程记录各组大鼠的一般情况和生存率。【结果】1.一般情况和生存率分析:MCT7W组从MCT注射后3~4周起,渐出现体重减轻、活动度下降、呼吸急促等表现,至7周末更为明显。MCT+A50组、MCT+A10组、MCT+P10组大鼠表现为活动度改善,体重增长基本正常。MCT7W组、MCT+A50组、MCT+A10组和MCT+P10组大鼠7周的生存率分别为44%、80%、75%和75%。与MCT7W组相比,3组治疗组经Log Rank检验的P值分别为0.016、0.028、0.028,具有统计学差异。正常对照组无任何大鼠死亡。2.有创血流动力学测定结果:MCT3W组的RVSP、mPAP均较正常对照明显上升(both p<0.01);MCT7W组的RVSP和mPAP进一步升高,而平均动脉压(mSAP)较正常组下降(p<0.05);与MCT7W组比较,不同剂量的阿托伐他汀及普伐他汀治疗明显降低RVSP、mPAP(all p<0.01),但未恢复至正常水平(all p<0.01);且3组治疗组间作用无统计学差异(p>0.05)。治疗组的mSAP亦已接近正常对照水平(all p>0.05)。3.右室肥厚程度的判定结果:与正常组相比,MCT3w组已存在右室肥厚(p<0.01),MCT7w组右室肥厚程度进一步增加(p<0.01)。与MCT7W组比较,不同剂量的阿托伐他汀及普伐他汀治疗明显降低RV/(LV+S)比值(all p<0.01),仍然高于正常水平(p<0.05 or p<0.01)。但3组治疗组间右室肥厚程度无统计学差异(p>0.05)。4.超声心动图检测结果:MCT3w组与正常组比较,RVWT已明显增加(p<0.05),PACT/CL虽有下降,但无统计学差异;至MCT造模的第7周末,RVWT进一步增加(p<0.01),RVEDD亦较正常明显增大(p<0.05),PACT/CL明显缩短(p<0.01)。不同剂量的阿托伐他汀及普伐他汀治疗4周后,右室游离壁厚度(RVWT)虽然未恢复至正常水平(all p<0.01),但均较MCT7W组明显改善(all p<0.01);3组治疗组的右室舒张末期内径(RVEDD)均已恢复正常对照水平(all p>0.05),PACT/CL较MCT7W组明显改善(all p<0.01),与正常对照接近(all p>0.05)。3组治疗改善RVWT、RVEDD及PACT/CL的程度无明显差异。此外,正常组、模型组、治疗组之间的肺脉内径、LVIDd、LVIDs和EF等指标均无差异(p>0.05)。5.组织病理学检查结果:光镜下可见MCT7W组大鼠终末细支气管旁小肺动脉中膜严重增厚,管腔几乎闭塞;而各治疗组小肺动脉中膜增厚明显减轻,接近正常对照水平。6.全血流式细胞术检查结果:基础状态下:MCT3w组和MCT7W组血小板纤维蛋白原的结合率均较正常显著升高(both p<0.01),但两者增高程度相似(p>0.05)。与MCT7W组相比,MCT+A50组的血小板纤维蛋白原的结合百分率明显降低(p<0.05),接近正常水平(p>0.05);MCT+A10组、MCL+P10组纤维蛋白原的结合百分率虽有下降趋势,但仍高于正常水平(both p<0.05)。加入刺激剂ADP后:MCT+A50组、MCT+A10组、MCT+P10组的纤维蛋白原的结合百分率均较MCT7W组明显下降(all p<0.05),与正常组相似(all p>0.05)。基础状态下:MCT3w组中性粒细胞(NEU)、单核细胞(MON)亚群CD11b的表达较正常明显增高(both p<0.01),MCT7w组NEU亚群的MFI较MCT3w组更为增高(p<0.01)。MCT+A50组、MCT+A10组、MCT+P10组抑制白细胞的NEU亚群的CD11b表达的能力相似,CD11b表达明显低于MCT7W组(all p<0.01),接近正常对照水平(p>0.05);同时,上述3组治疗组也能降低MON亚群的CD11b表达(p<0.05 or p<0.01),但MCT+A50组的作用更为明显(p<0.01)。加入刺激剂fMLP后:MCT3w组、MCT7W组的NEU亚群的MFI较正常对照增高更明显(both p<0.01)。与MCT7W组相比,MCT+A50组、MCT+A10组均能显著抑制NEU CD11b的表达(p<0.01,p<0.05 respectively);MCT+A50组抑制作用优于MCT+A10组、MCTP10组(p<0.05,p<0.01 respectively),而MCT+P10组与MCT7W组相比无统计学差异(p>0.05)。3个治疗组抑制MON亚群的能力相似(p>0.05)。基础状态下或ADP刺激后,MCT3w组、MCT7W组的血小板-中性粒细胞(P-NEU)的聚集体形成较正常对照组明显增多(both p<0.01);MCT+A50组、MCT+A10组、MCT+P10组均能显著降低P-NEU聚集体形成,明显低于MCT7W组水平(p<0.01 or p<0.05),与正常对照组接近(p>0.05);并且,3组治疗组降低P-NEU聚集体的能力无明显差异(p>0.05)。各组别血小板-单核细胞(P-MON)及血小板-淋巴细胞(P-LYM)聚集体的形成率无统计学差异(p>0.05)。7.Western blot法检测血小板p38 MAPK蛋白磷酸化的结果:MCT7W组磷酸化p38 MAPK的相对活性明显增加(p<0.01),MCT+A50组能显著降低升高的磷酸化p38 MAPK蛋白表达至正常水平(p>0.05);与MCT7W组相比,MCT+A10组、MCT+P10组也能降低磷酸化p38 MAPK蛋白表达,但仍高于正常对照组(both p<0.05)。【结论】1.野百合碱诱导的3周和7周模型大鼠,肺动脉压力增高、右心室肥厚、小肺动脉中膜增厚,证明建立了稳定可靠的慢性肺动脉高压模型。2.MCT-PAH模型大鼠存在循环血小板和白细胞的激活,并且表现为对刺激剂高敏感;基础状态和刺激剂作用下,模型大鼠的循环血小板-中性粒细胞聚集体形成均明显增加。3.MCT-PAH模型大鼠血小板p38 MAPK蛋白的磷酸化明显增强。4.大、小剂量的阿托伐他汀(脂溶性)和普伐他汀(水溶性)均能降低MCT-PAH模型大鼠的平均肺动脉压、减轻右室肥厚和改善生存率,它们的作用无明显不同。5.大、小剂量的阿托伐他汀(脂溶性)和普伐他汀(水溶性)均能减轻MCT-PAH大鼠循环血小板、白细胞的活化和血小板-中性粒细胞聚集体形成;阿托伐他汀和普伐他汀治疗均能一定程度地降低MCT-PAH大鼠血小板磷酸化p38 MAPK蛋白的表达,且大剂量的阿托伐他汀的作用更为明显。
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