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小型猪专用复合麻醉剂(XFM)及其颉颃剂具有效果确切、安全、副作用小及使用方便的特点。但目前其麻醉镇痛和催醒机理尚未完全阐明。最新研究表明细胞内信号转导系统与动物全身麻醉及催醒机制有密切的联系。LKB1-AMPK-mTOR信号通路在调控局部树突兴奋性调节及麻醉长时程调节中起重要作用,因此,推测m TOR可能参与了麻醉的镇痛调控。Orexin系统可调控睡眠与觉醒,推测Orexin系统参与了麻醉的催醒调控。为全面了解XFM及其颉颃剂在大鼠中枢神经系统中的交互作用,本实验从LKB1-AMPK-mTOR信号通路和Orexin系统两方面进行研究。首先,以切口痛大鼠为模型,选取m TOR信号转导系统中关键蛋白LKB1、AMPK及下游转录因子4EBP1,研究XFM及其颉颃剂的麻醉镇痛机理,从分子水平对XFM及其颉颃剂交互作用机制进行探讨。其次,选取Orexin A和Orexin B研究XFM及其颉颃剂的催眠与觉醒机理,分析XFM及其颉颃剂在大鼠下丘脑侧脑区的交互作用。实验分为XFM及其颉颃剂对mTOR信号系统和对Orexin系统的作用两部分。研究对mTOR信号系统的作用:将126只SD大鼠分为空白对照组(6只),切口痛对照组(24只),生理盐水切口痛组(24只),麻醉剂组(24只),颉颃剂组(24只)和麻醉催醒交互组(24只)。除空白对照组外,其余各组大鼠于腹腔注射0.5%戊巴比妥钠30 mg/kg后,对足底实施手术切割建立切口痛模型。各组大鼠分别腹腔注射生理盐水、XFM或/和颉颃剂(对照组不给药)后,在相应时间点采用颈部移位法处死大鼠并迅速取样,取样部位为大脑、海马、丘脑、小脑、脑干和脊髓L4~L5节段。利用荧光定量PCR技术检测各样品LKB1 m RNA、AMPKα1 mRNA、AMPKα2 mRNA和4EBP1 m RNA的相对转录量,利用western blot方法检测各样品p-LKB1/LKB1、p-AMPKα/AMPKα和p-4EBP1/4EBP1蛋白质磷酸化水平。研究对Orexin系统的作用:将78只SD大鼠分为空白对照组(6只),麻醉剂组(24只),颉颃剂组(24只)和麻醉催醒交互组(24只)。各实验组大鼠分别腹腔注射XFM和/或颉颃剂后,在相应时间点处死并采取下丘脑侧脑区。利用荧光定量PCR技术检测Prepro-orexin mRNA的相对转录量,Western blot方法检测Orexin A、Orexin B蛋白的相对表达量。实验结果:(1)XFM及其颉颃剂对切口痛大鼠不同脑区及脊髓LKB1的影响XFM能明显激活大鼠脑内小脑、丘脑、海马和脑干内LKB1 mRNA转录和蛋白磷酸化,磷酸化水平与mRNA转录变化较为一致;单独腹腔注射颉颃剂能抑制大脑、小脑、海马和脊髓内LKB1 m RNA转录和蛋白磷酸化;使用颉颃剂催醒XFM后,切口痛大鼠大脑和小脑的LKB1蛋白磷酸化水平与对照组相比极显著降低(P<0.01),表明XFM的全麻作用可能与诱导小脑、丘脑、海马和脑干内的LKB1 mRNA转录和蛋白磷酸化有关,颉颃剂的催醒作用可能与其在小脑和海马逆转XFM对LKB1的诱导激活有关。(2)XFM及其颉颃剂对切口痛大鼠不同脑区及脊髓AMPK的影响切口痛大鼠小脑、丘脑、脑干、海马和脊髓部位的AMPKα1和AMPKα2 mRNA相对转录量和AMPKα磷酸化水平在XFM麻醉后,与对照组相比极显著升高(P<0.01),且磷酸化水平与mRNA转录水平一致;单独腹腔注射颉颃剂能明显抑制小脑、海马和脑干的AMPKα磷酸化水平和mRNA转录;使用颉颃剂催醒XFM后,小脑、脑干和脊髓的磷酸化水平和mRNA转录受到抑制,表明XFM的全麻作用可能与诱导小脑、丘脑、脑干、海马和脊髓内的AMPKα磷酸化和mRNA转录有关,颉颃剂的催醒作用可能与其在小脑、海马和脑干逆转XFM对AMPKα的诱导激活有关。(3)XFM及其颉颃剂对切口痛大鼠不同脑区及脊髓4EBP1的影响XFM能极显著升高切口痛大鼠各个脑区及脊髓部位的4EBP1 mRNA相对转录量和磷酸化水平(P<0.01);小型猪麻醉颉颃剂能显著降低小脑、丘脑、海马、脑干的4EBP1 m RNA相对转录量和磷酸化水平(P<0.05),使用颉颃剂催醒XFM后,大脑、小脑和丘脑的磷酸化水平与对照组相比受到显著抑制(P<0.05),XFM的全麻作用可能与诱导各个脑区及脊髓4EBP1 mRNA相对转录和磷酸化有关,颉颃剂的催醒作用可能与其在小脑、丘脑、海马、脑干逆转XFM对4EBP1的诱导激活有关。(4)XFM及其颉颃剂对Prepro-orexin mRNA转录和Orexin A、Orexin B表达的影响XFM能极显著抑制下丘脑侧脑区Prepro-orexin m RNA的转录(P<0.01),显著降低Orexin A和Orexin B蛋白表达(P<0.05),单独腹腔注射颉颃剂能激活下丘脑侧脑区Prepro-orexin mRNA转录,促进Orexin A和Orexin B蛋白表达。使用颉颃剂催醒XFM后,大鼠下丘脑侧脑区Prepro-orexin mRNA的转录和Orexin A蛋白表达与对照组相比显著降低(P<0.05),表明XFM的作用是通过抑制下丘脑侧脑区Prepro-orexin mRNA转录和Orexin A、Orexin B蛋白表达进行的,颉颃剂的促觉醒作用是可能与逆转下丘脑侧脑区Prepro-orexin mRNA转录和Orexin A蛋白表达有关。综上所述得出以下结论:(1)XFM对LKB1-AMPK-m TOR信号通路及下游因子具有一定的激活作用,这种促进作用主要与小脑、丘脑、海马、脑干有关,这可能是该LKB1-AMPK-mTOR信号通路参与麻醉与镇痛的靶位。(2)小型猪麻醉颉颃剂能够抑制切口痛大鼠不同脑区及脊髓内的LKB1-AMPK-mTOR信号通路及下游因子,对小脑和海马部内的信号分子抑制较明显,颉颃剂效能的发挥可能是通过LKB1-AMPK-mTOR信号通路来实现的。(3)小型猪麻醉颉颃剂与XFM对LKB1-AMPK-m TOR信号通路及下游因子的作用相反,这可能是XFM与颉颃剂的交互作用在分子水平的体现,但颉颃剂未能完全逆转XFM对LKB1-AMPK-mTOR信号通路的影响,说明中枢神经系统存在其他信号转导网络影响麻醉与催醒的机理。(4)XFM作用于下丘脑侧脑区对Orexin系统产生抑制作用,小型猪麻醉颉颃剂能逆转XFM在下丘脑侧脑区对Orexin的抑制作用,下丘脑侧脑区可能是Orexin系统参与麻醉与苏醒的部位之一。