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目的：膜联蛋白Annexin a2(以下简称Anxa2)是一种钙依赖蛋白,广泛高表达于各种癌组织中,在肿瘤血管生成、细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭以及粘附等功能中起多重作用。本组前期研究发现,Anxa2能够调节乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,并调节细胞周期相关蛋白C-myc, Cyclin D1和侵袭相关蛋白MMP-2, MMP-9的表达。这些蛋白都是信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription3, Stat3)的下游响应因子。本组前期研究发现,Anxa2和和Stat3间存在相互作用,但是Anxa2本身并没有影响Stat3的表达水平。Anxa2与Stat3都是酪氨酸磷酸化蛋白,因此我们推测Anxa2可能通过自身的酪氨酸磷酸化来调节Stat3的磷酸化,进而调控Stat3下游响应蛋白因子的表达。本实验应用点突变技术,获得Anxa2基因的持续激活和持续抑制的两种突变体,通过感染／转染技术,获得稳定表达相应蛋白的细胞模型,在已有研究结果上进一步探索Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化对于其自身活性及其调节乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭所起的作用,并为研究Anxa2与Stat3相互作用的机制寻找新的线索。方法：1.应用亚克隆技术,获得表达Anxa2及其第23位酪氨酸的突变体的载体质粒,pCDH-EGFP-Anxa2WT, pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D。采用慢病毒感染以及脂质体转染技术,获得表达Anxa2-WT及其突变体Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D的SK-BR-3及MCF-7稳定细胞系。2.应用MTT实验检测Anxa2-WT, Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D对SK-BR-3和MCF-7细胞的增殖能力的影响。3.应用克隆形成实验检测Anxa2-WT, Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D对SK-BR-3和MCF-7细胞的克隆形成能力的影响。4.应用划痕实验检测Anxa2-WT, Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D对MCF-7细胞的体外迁移能力的影响。5.采用transwell小室体外迁移、侵袭实验检测Anxa2-WT, Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D对SK-BR-3和MCF-7细胞的体外迁移、侵袭能力的影响。6.应用RT-PCR技术来检测Stat3在乳腺癌患者的导管内癌、浸润性导管癌中的mRNA表达水平,并分析与Anxa2mRNA表达水平的相关性。7.采用免疫共沉淀技术检测SK-BR-3细胞中Anxa2与Stat3的相互作用。8.应用Western blotting技术检测Anxa2-WT, Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D对周期相关蛋白Cyclin D1表达水平的影响。9.应用Western blotting技术检测Anxa2-WT, Anxa2-Y23A,和Anxa2-Y23D对Stat3在乳腺癌细胞SK-BR-3细胞核和浆中的分布和激活的影响。结果：1.亚克隆技术获得野生型的重组慢病毒质粒pCDH-EGFP-Anxa2WT,并获得Anxa2的突变质粒pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D。2.重组/突然变质粒成功感染/转染人乳腺癌细胞株SK-BR-3和MCF-7。3.野生型Anxa2-WT及其突变体Anxa2-Y23A, Anxa2-Y23D在乳腺癌细胞株SK-BR-3和MCF-7中稳定表达。4.免疫荧光检测野生型Anxa2-WT主要定位于乳腺癌细胞株SK-BR-3和MCF-7中细胞膜和浆。5. Anxa2-WT和Anxa2-Y23D增强乳腺癌细胞的增殖与克隆形成能力。6. Anxa2-WT和Anxa2-Y23D提高乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。7. Stat3mRNA在乳腺癌浸润性导管癌中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.0001)和导管内癌(.P<0.0001)中的表达；并与Anxa2mRNA在浸润性导管内癌中的表达具有相关性。8.免疫共沉淀发现Stat3与Anxa2在SK-BR-3细胞中存在相互作用。9.免疫印迹发现总裂解液中Anxa2-WT, Y23D对Stat3表达水平没有影响,但是生长因子刺激后P-Stat3的表达水平有提高趋势,而细胞周期蛋白Cyclin D1的表达则明显提高。10.免疫印迹发现Y23D能够促进Stat3的磷酸化,活化的Stat3进入细胞核中。结论：1. Anxa2第23位酪氨酸磷酸化对于其促进乳腺癌增殖、迁移和侵袭具有重要作用。2. Anxa2第23位酪氨酸磷酸化能够促进Stat3的磷酸化,从而使其活化并进入核中调节下游靶蛋白因子的表达,最终调节乳腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭。