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酵母Saccharomycescerevisiae体内的prion蛋白Ure2在体内和体外都会形成淀粉样纤维,其富含天冬酰胺和谷氨酰胺重复序列的N-端(1-89)与prion性质密切相关,与哺乳动物的Prion蛋白序列有相似性。其N-端的15-42位残基是夹在两段重复序列中的随机序列,相对疏水,在种间高度保守。整个N-端在体内对于Ure2的氮调控能力,在体外对于分子的稳定性,折叠以及二聚化都没有影响。我们以硫黄素T(ThT)结合荧光和原子力显微镜(AFM)监测Ure2及其prion结构域不同程度缺失的突变体在不同条件下的纤维化动力学过程。发现Ure2淀粉样化动力学过程中有一系列颗粒和纤维中间体分时分步出现:有高度分别为5、8、12、9纳米,扭曲或平滑的纤维在对应于ThT结合所追踪的荧光强度上升的平台期的早期和晚期的不同时段出现。AFM以高度信息成像,Ure2的双体和寡聚体的高度通过AFM得以确定。突变体15Ure2和△15-42Ure2的纤维化也同样有多个中间体的分步出现,但是以ThT结合荧光监测的结果显示它们的延迟期较野生型更长。此外结果表明,△15-42Ure2对ThT的结合较弱。我们的工作说明15-42位保守区域对于淀粉样成核以及与ThT结合面的形成都有重要作用,并且Ure2和N-端突变体的淀粉样化动力学过程都遵循经由多个中间体的分步组装的机制。
Ure2的C-端与谷胱甘肽转移酶类似,但缺乏典型的谷胱甘肽转移酶酶活。我们实验室已经实测到Ure2的过氧化物酶活性,并且证实即使在形成淀粉样纤维之后Ure2仍然保持酶活性。之前已有体内实验证实,C-端的某些区域对于Ure2的prion性质也有影响:去除224位附近的氨基酸残基将会削弱Ure2体内的prion诱导能力。我们以ThT结合荧光和AFM监测Ure2及其C-端的突变体在不同条件下的纤维化动力学过程。突变体△221-227Ure2的纤维化动力学过程与野生型Ure2一样,也同样有多个中间体的分步出现,但是ThT结果显示它的淀粉样纤维化延迟期比野生型Ure2的长。221-227位氨基酸残基的缺失将降低Ure2分子天然态的稳定性,但是并不影响胍变性稳态过程的第二个transition。圆二色谱以及荧光光谱显示,△221-227Ure2和野生型Ure2的结构无明显差别。