论文部分内容阅读
条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的小麦条锈病是一种世界性病害,严重危害世界粮食产量。作为一种专性寄生菌,条锈菌萌发以后从气孔入侵,在寄主的细胞间隙里形成初生菌丝,然后形成吸器不断从寄主细胞内吸收营养,并在细胞间隙产生大量次生菌丝,与寄主建立寄生关系。在此过程中,病菌会分泌毒性因子进入细胞间隙,而寄主也会分泌抗病蛋白进入细胞间隙,因而,寻找胞间蛋白对于揭示条锈菌与小麦互作机理具有重要意义。为此,本实验建立了一种提取细胞间隙液蛋白的方法,通过对提取的胞间蛋白进行质谱分析,以及对条锈菌效应蛋白的亚细胞定位,结果如下:通过对蛋白浓度的测定及6-磷酸葡萄糖脱氢酶的鉴定,最终将提取方法确定为:以50 m Mol/L PBS为缓冲液-0.1 MPa负压处理5 min,4℃2000 rpm离心5 min收集胞间液经丙酮沉淀、低温离心、冷冻干燥后得到小麦细胞间隙液蛋白;以接种条锈菌的小麦叶片作为实验组,以接种蒸馏水的小麦叶片为对照组,在12 h、48 h、7 d时采样,提取细胞间隙液蛋白。通过将提取到的细胞间隙液蛋白经胰蛋白酶酶解、TMT标记、LC-MS分析、生物信息学分析后共得到772个蛋白,其中612个是小麦蛋白,160个是条锈菌蛋白。分别对小麦和条锈菌蛋白进行分析,小麦蛋白中12 h、48 h、7 d三个时间点上调表达的蛋白数目分别是200、215、133个。对这些上调表达的蛋白分别进行GO分析,结果表明三个时间点上调表达的小麦蛋白主要存在于胞外区、质体间质、细胞壁等部位且这些蛋白与可能与抗病反应相关。160个条锈菌蛋白中有115个假想蛋白,29个核糖体蛋白以及腺苷高半胱氨酸酶等其它蛋白。对筛选到的假想蛋白进行信号肽及结构域预测的结果显示115个假想蛋白中有20个蛋白带有信号肽,89个蛋白具有结构域,需要进一步预测验证这些蛋白是否是条锈菌效应蛋白。通过将目的基因构建到1302-eGFP融合表达载体上,借助农杆菌侵染系统在烟草中表达融合蛋白,在荧光显微镜的BW、YFP和明场下观察定位情况,探究这些效应蛋白在细胞内的定位情况。对效应蛋白的定位结果显示:PST-Hasp97、PST-Hasp260、PST-Hasp257定位在细胞质和细胞膜上,PST-Hasp68定位在细胞质、细胞膜、细胞核上,PST-8603定位在细胞核上,表明了效应蛋白作用方式的多样性。