【摘 要】
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本研究中首先以小麦及其近缘属作为研究材料,对秦岭黑麦、旱雀麦、沙融山羊草、带芒草、长穗偃麦草和普通小麦(L2、L4和CN16)在低钾条件下的生理情况进行了探索。然后通过RACE
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本研究中首先以小麦及其近缘属作为研究材料,对秦岭黑麦、旱雀麦、沙融山羊草、带芒草、长穗偃麦草和普通小麦(L2、L4和CN16)在低钾条件下的生理情况进行了探索。然后通过RACE的方法从秦岭黑麦中分离得到氢离子焦磷酸化酶基因的cDNA全长,并且通过同源克隆、高效热不对称PCR等方法,获得黑麦氢离子焦磷酸化酶的基因全长,进一步对该基因的结构、表达模式进行分析。主要研究结果如下: 1.通过水培的方法筛选了耐低钾的材料,同时结合材料自身的特性,确定了本实验克隆所需要的材料。 2.根据其他物种中克隆得到的氢离子焦磷酸化酶基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR和RACE的方法首次从秦岭黑麦中克隆得到ScHP1 cDNA全长2629bp,其中包括2289bp的开放阅读框和340bp的3非编码区。开放阅读框编码762个氨基酸,预测其分子量为79.4 kDa。并通过高效热不对称PCR和普通PCR的方法获得基因全长为4354bp。 3.对ScHP1进行跨膜结构预测,发现其有14个跨膜结构域。将克隆得到的序列与普通小麦、乌拉尔图小麦、节节麦、二穗短柄草、大麦、水稻和玉米的氢离子焦磷酸化酶进行同源性比较发现:氨基酸序列5端变化相对较大,而在3端高度保守。并且含有4个保守结构域,分别是GGG,DVGADLVGKVE,DNVGDNNGD,EYYT,GNTTAA。三维结构预测ScHP1显示该蛋白由两条链组成,1个钾离子结合位点以及10个镁离子结合位点。 4.将ScHP1连入含有黄色荧光蛋白基因的质粒pA7-YFP进行融合表达,然后通过基因枪法将对照质粒pA7-YFP和重组质粒pA7-ScHP1-YFP转入洋葱表皮细胞进行瞬时表达实验,对照质粒pA7-YFP在整个细胞中都有荧光出现,而重组质粒仅在细胞膜上出现了黄色荧光,说明该基因在黑麦中定位于细胞质膜上。 5.将秦岭黑麦在低N、P、K和低温、干旱、高盐下进行72h胁迫,检测ScHP1表达情况。荧光定量实验结果表明ScHP1在秦岭黑麦中的表达具有组织特异性。在低N、低温、高盐胁迫下,整个胁迫过程中ScHP1在叶中表达量都呈现上升趋势。但是,在低P、低K和干旱胁迫下,ScHP1在叶的表达量在36-48h达到最大,然后逐渐下降。ScHP1在低钾胁迫下,根中的表达量先上升再下降并且48h达到最大。除此之外,根中的表达在其他所有胁迫下一开始很低,然后逐渐上升直到最后。ScHP1在各种胁迫下茎中的表达量都比较低。这些结果进一步证表明ScHP1在秦岭黑麦抗逆反应中起到至关重要的作用。
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