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禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）是全世界家禽疾病中重要的病原之一,宿主谱广泛,既能使宿主产生疾病,又能引起宿主免疫抑制,既可水平传播也能垂直传播。世界各地均有ARV感染的病例,我国自20世纪80年代中期以来已有多个省市发现本病,严重影响了养禽业的发展。感染ARV后造成家禽饲养业的重大经济损失,强调了研究新出现的ARV分离株的患病率、遗传特征和致病性进化的重要性。目前没有直接作用的抗ARV药物,且目前市场上主流疫苗株S1133、减毒S1133和1733均为鸡源毒株,对水禽源毒株的免疫效果不佳。所以,分离鉴定ARV毒株、寻找新型的ARV感染后的治疗策略、探索该病新的防控技术具有较大的科学意义与应用价值。本研究针对ARV进行了分离鉴定并且对运用RNA干扰技术抑制ARV的复制进行了初步研究。1.禽呼肠孤病毒的分离与鉴定为了了解ARV的感染情况,本研究采用RT-PCR方法检测病料肝脏、脾脏研磨液中ARV的感染情况,并将PCR阳性病料通过接种鸡胚、CEF、Vero细胞分离病毒并测定了病毒的血凝性及感染力。分离得到的8株ARV毒株全部可以感染CEF细胞产生细胞病变,而只有ARV-SD-2021-1和ARV-SD-2021-3可以感染Vero细胞产生细胞病变并在48h时病毒滴度最高。对ARV-SD-2021-1和ARV-SD-2021-3进行全基因测序。与GenBank上已发布的ARV序列进行了同源性和遗传进化分析以及生物信息学分析。结果表明目前市场上主流疫苗株S1133、减毒S1133和1733均为鸡源毒株,对水禽源毒株的免疫效果不佳。从鸡分离得到的ARV-SD-2021-1属于水禽源ARV,说明水禽源ARV一样可以感染鸡,存在交叉感染的现象,这对ARV的防控提出了巨大的挑战。综上所述,本研究成功分离到8株ARV毒株,并通过对部分分离株的全基因进行遗传进化和生物信息学分析,有助于了解ARV流行毒株的遗传变异情况,为后续ARV的防控及疫苗的研发提供依据。2.amiRNA抑制ARV在Vero细胞中的复制为了寻求治疗ARV的新方法,本研究设计并化学合成12个靶向L2基因保守序列的amiRNA,经测序鉴定正确,将其转染Vero细胞,在转染48h后感染ARV-SD-2021-1毒株,在感染后48h收集细胞和细胞上清,通过TCID50、Real-time PCR验证amiRNA抑制ARV的效果进行初筛。结果显示,构建得到的amiRNA均能不同程度的有效抑制ARV在Vero细胞中的复制。将初筛得到抑制效果最好的4个amiRNA（amiRNA-420、amiRNA-1107、amiRNA-1979、amiRNA-2863）进行进一步验证,在感染后 24h、48h、72h收集细胞和细胞上清,通过细胞病变效应（CPE）、TCID50、Real-time PCR和Western blot检测amiRNA抑制ARV的效果。结果显示,在24h和48h时amiRNA-420抑制ARV效果最佳,amiRNA-1107次之。在72h,amiRNA-1979抑制ARV效果最佳,amiRNA-420效果次之。综上所述,本研究针对ARV的L2基因的保守区域成功构建了 amiRNA,为RNA干扰技术在抗ARV治疗领域的应用以及为动物机体抗ARV感染的研究提供了基础。3.amiRNA多靶点串联表达载体抑制ARV在Vero细胞的复制为了可以实现对不同基因型ARV毒株的抑制,避免病毒突变逃逸,发挥持久的抗病毒作用,本研究将上述抑制ARV效果好的单amiRNA序列串联构建了 amiRNA多靶点串联表达载体amiRNA-420+1107和amiRNA-420+1979。将单靶点和多靶点amiRNA转染Vero细胞,在转染48h后感染ARV,在感染后24、48、72h收集细胞和细胞上清,通过细胞病变效应（CPE）、TCID50、Real-time PCR 和 Western blot 检测 amiRNA抑制 ARV 的效果。结果显示,amiRNA-420+1107 和 amiRNA-420+1979 在 24、48、72h均能稳定抑制ARV在Vero细胞的复制,抑制效果在三个时间段均略强于抑制效果最强的单靶点amiRNA。综上所述,本研究成功构建了多靶点串联amiRNA表达载体,并在Vero细胞上证明了其对ARV复制的抑制效果,将为使用RNA干扰技术抑制ARV不同基因型分离株奠定理论基础和材料基础,为防治ARV提供潜在的途径,为后续动物实验提供材料。