论文部分内容阅读
国内外及本实验室多项研究证实,粘附分子在气道炎症及损伤修复中发挥重要作用。支气管上皮细胞表达的粘附分子参与气道上皮对应激刺激的应答,表现为:通过与基质的结构性粘附维持上皮的结构完整,并参与细胞的抗氧化、增殖迁移和损伤修复功能;通过与白细胞的炎症性粘附激活传递炎症或应激信号。本课题组前期研究中发现连环素(catenin)家族中的CTNNAL1(catenin alpha-like1)基因在哮喘病人的外周血和支气管粘膜中表达下调,提示其与哮喘相关,但是在在急性应激的动物模型及培养的人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells, HBECs)损伤边缘高表达,提示CTNNAL1可能参与气道应激反应,参与维持气道上皮的完整,其表达下调可能导致上皮功能缺陷及完整性破坏。因此,为探讨CTNNAL1在气道上皮应激反应中的功能意义,本课题拟研究CTNNAL1对HBECs粘附功能的影响。目的:观察不同表达水平的CTNNAL1对HBECs增殖和粘附功能以及部分粘附分子表达的影响,初步探讨CTNNAL1在气道上皮应激反应中的功能意义。方法:(1)构建CTNNAL1不同表达水平的重组质粒,用G418筛选稳定转染重组质粒的HBECs,建立稳定细胞系。用实时荧光定量PCR和流式细胞术检测稳定细胞系中CTNNAL1的表达。(2)将CTNNAL1不同表达水平的HBECs系用细胞核荧光染料碘化丙啶(PI)进行染色,采用流式细胞术检测细胞周期。(3)MTT法检测CTNNAL1不同表达水平的HBECs系与鼠尾胶原的基质性粘附能力。(4)用FITC标记人WBC的CD45分子,与CTNNAL1不同表达水平的HBECs系粘附,用流式细胞术检测粘附的WBC的数量,反映各种HBECs系的炎症性粘附能力。(5)采用RT-PCR观察CTNNAL1不同表达水平的HBECs系中上皮钙粘附素(E-cadherin)和细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达变化。(6)ELISA法检测各组HBECs系中IL-8的分泌量。结果:(1)成功构建pcDNA3.1(-)-cyc-his/CTNNAL1高表达质粒和pGCsilencerU6/Neo/RFP/CTNNAL1-RNAi沉默质粒,并以此分别转染HBECs,成功构建稳定转染细胞系,与空载体相比,pcDNA3.1(-)-cyc-his/CTNNAL1重组质粒的HBECs系中CTNNAL1mRNA水平及蛋白水平均显著升高;与阴性对照质粒的HBECs系相比,CTNNAL1-RNAi沉默质粒的HBECs系中CTNNAL1mRNA水平及蛋白水平均显著降低。(2) CTNNAL1高表达HBECs系增殖活跃,表现为(G2+S)/G1细胞百分比增加199.84%。(3) CTNNAL1高表达增强了HBECs对基质的粘附能力,CTNNAL1沉默后降低了HBECs的基质粘附率,且在30min,120min有统计学差异。(4) CTNNAL1高表达使HBECs与人总WBC的炎性粘附细胞百分比降低了35.3%。(5) CTNNAL1高表达增加了HBECs中粘附分子E-cadherin mRNA水平的表达(56.5%),降低了ICAM-1的表达(90.4%);CTNNAL1沉默后降低了E-cadherin mRNA水平的表达(59.9%)(6) CTNNAL1高表达使HBECs分泌的IL-8减少了53.87%。结论:CTNNAL1可显著促进HBECs增殖,通过促进E-cadherin的表达提高HBECs对基质的粘附能力,通过降低ICAM-1的表达和减少IL-8的分泌减弱HBECs与人WBC的炎症性粘附能力。