第一部分由聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体对脱矿牙本质再矿化的研究目的:检测由聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体对脱矿牙本质的再矿化效果,并“指纹”性识别仿生再矿化涂层的动态组份变化,评价其未来的临床应用前景。实验一:“类海水”矿化前驱体的制备及其对脱矿牙本质的再矿化效果评价材料与方法:收集并挑选符合要求的第三恒磨牙,流水冷却下采用慢速锯磨制1.0±0.1 mm厚的牙本质片样本。梯度抛光表面并用蒸馏水超声清洗后,将样本置于EDTA溶液（0.5 M,pH 7.4）中浸泡5 min去除玷污层,以实现部分脱矿来模拟牙本质敏感模型。基于可逆反应（CaCO3+CO2+H2O（?）Ca（HCO3）2）制备“类海水”矿化前驱体并将上述敏感牙本质样本按照不同的处理方式随机分为3组:DW组,Ca2+组和Ca2+-Mg2+-PAA组。在三种矿化液内浸泡7d后,采用显微硬度仪和液压渗透性装置检测牙本质片的机械特性和渗透性变化,并分别于1d、3d、7d时应用FE-SEM观测其动态形貌变化。最后,利用6%柠檬酸（pH=1.5）处理样本1 min以体外模拟口腔的酸性环境,通过再次检测其表面矿物质形貌、机械特性和渗透性变化,评估其抗酸能力。结果:此矿化前驱体的应用诱导形成了仿生再矿化涂层,显著地降低了敏感牙本质模型的渗透性,提高了表面的显微硬度,有效地封闭了牙本质小管并展现出一定的耐酸稳定性,在未来治疗牙本质敏感的临床应用方面具备一定的潜力。实验二:“类海水”矿化前驱体诱导的再矿化涂层的动态组份分析材料与方法:收集并挑选符合要求的第三恒磨牙,流水冷却下采用慢速锯磨制1.0±0.1 mm厚的牙本质片样本。梯度抛光表面并用蒸馏水超声清洗后,将样本置于EDTA溶液（0.5 M,pH 7.4）中浸泡5 min去除玷污层,以实现部分脱矿来模拟牙本质敏感模型。基于可逆反应（CaCO3+CO2+H2O（?）Ca（HCO3）2）制备“类海水”矿化前驱体并将上述敏感牙本质样本按照不同的处理方式随机分为3组:DW组,Ca2+组和Ca2+-Mg2+-PAA组。牙本质样本在三类矿化溶液内浸泡孵育的不同时间点（Baseline、1d、3d、7d）及弱酸处理后,联合XRD,ATR-IR和Raman三种非破坏性检测手段,对样本表面形成的矿化涂层进行原位、无损以及分子水平的“指纹”特征识别,以监测其在不同矿化、成熟过程中的精细组份变化。结果:本研究结果验证了 PAA-Mg-ACC前驱体在矿化过程中的无定形相的媒介作用,其逐渐成核矿化生长,最终形成方解石矿物涂层,并展示出一定的抗酸性。同时,脱矿牙本质样本内部残余的磷酸盐晶体也参与了矿化过程。第二部分由聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体的矿化机制初探目的:构建重组Ⅰ型胶原蛋白模型,并评估由聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体的纤维内矿化能力,以深入探索验证第一部分实验的矿化机制。实验三:Ⅰ型胶原纤维的重组和表征材料与方法:取适量来源于牛皮肤的Ⅰ型胶原蛋白冻干粉,4℃冷房内溶于冰醋酸以制备胶原-醋酸溶液（浓度为0.02mg/ml）。将TEM镍网的含碳膜面朝下浸泡于上述溶液中,利用含氨水的密闭环境中和其PH,然后用封口膜封闭,室温下孵育3天以实现胶原重组。为增加胶原结构的稳定性,将50μl 0.3MEDC溶液滴加于上述镍网表面,充分交联3小时后室温下自然干燥。最后采用1%的醋酸铀溶液染色镍网表面5min,在TEM下观察重组Ⅰ型胶原的超微结构确定胶原纤维的成功自组装,同时采用选区电子衍射（SAED）对重组胶原纤维进行晶体学分析。结果:结果显示本实验成功构建了非晶相的重组Ⅰ型胶原纤维模型。可见视野内的重组Ⅰ型胶原结构完整,呈现出典型的深浅条纹状,明暗相间,首尾相接,在纤维轴的方向以67nm为单位周期性地重复出现。各纤维独立排列,无堆叠,便于后期形貌观察和实验效果的评价。实验四:“类海水”矿化前驱体对重组Ⅰ型胶原纤维的矿化材料与方法:通过实验三验证非晶相的重组Ⅰ型胶原纤维模型的成功构建后,取同批次未经醋酸铀染色的重组胶原TEM镍网并随机分为3组,分别悬浮于200ml矿化液内（即DW组,Ca2+组和Ca2+-Mg2+-PAA组）,容器口敞开并置于37℃恒温箱内孵育30min,2天和3天。在各个时间点,采用蒸馏水反复润洗样本后自然干燥,进行TEM和SEM的观察,并采用选区电子衍射（SAED）分析对重组胶原纤维进行晶体学分析确认是否有纤维内矿化的发生以及形成的晶体类型。结果:本实验构建的聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体可进行有效的二维重组Ⅰ型胶原纤维内矿化和晶体外延生长,成功证实了第一部分实验的初期猜测。第三部分由聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体的细胞生物学反应目的:评估由聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体对于人类牙髓细胞的形态和增殖状态的影响。实验五:“类海水”矿化前驱体对细胞形态和生长状态的影响材料与方法:采用组织块法分离人类原代牙髓细胞HDPCs,传代备用。同时,将三种矿化液用0.22 μm一次性针式滤器过滤使其达到无菌条件,然后与标准培养基按体积梯度稀释为含量为10%,20%,40%的混合溶液以备用,即包含九组:10%DW,20%DW,40%DW,10%Ca2+,20%Ca2+,40%Ca2+,10%Ca2+-Mg2+-PAA,20%Ca2+-Mg2+-PAA,40%Ca2+-Mg2+-PAA。使用梯度稀释的矿化液培养生长在细胞爬片上的HDPCs,24h后依次采用戊二醛固定细胞,乙醇梯度脱水后,于FE-SEM下观察细胞形态,另外采用罗丹明-鬼笔环肽和DAPI染色后于荧光显微镜下观察细胞骨架。此外,运用CCK-8和BCA试剂盒分别评估HDPCs的短期和长期增殖生长情况,并计算细胞相对增殖率以便评估其细胞毒性。结果:本实验构建的聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体在一定浓度范围内具有良好的生物相容性,其促进细胞增殖的组份主要来源于Ca2+和Mg2+。结论:1、本研究借鉴贝壳形成的潜在原理以及人工贝壳结构仿生矿化的新技术和新理论,成功制备出聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体。此矿化前驱体的应用有效地封闭了牙本质小管并展现出一定的耐酸稳定性,对未来治疗牙本质敏感方面的临床应用具有一定的潜力。2、对样本表面矿物组份的动态鉴定和定量监测的研究结果验证了此前驱体在脱矿牙本质矿化过程中的无定形相的媒介作用,最终形成方解石矿物涂层。辅助证实了此矿化前体液对于牙本质小管封闭的有效性,为深入探索其矿化演变机制提供了可靠的分子水平的数据依据。3、本研究成功建立了非晶相的重组Ⅰ型胶原纤维模型,并验证此矿化前驱体可进行有效的二维重组Ⅰ型胶原纤维内的矿化和晶体外延生长,揭示了其对脱矿牙本质模型的再矿化效果的分子机制。4、本实验构建的聚合物稳定的液相“类海水”矿化前驱体在一定浓度范围内展示出良好的生物相容性,具有一定的临床应用前景。5、“自下而上”的珍珠层结构仿生概念初步成功地应用于人类牙本质的再矿化研究中,为未来研究设计的改进奠定基础,同时为未来的临床应用治疗提供新思路。