水蕨科(Parkeriaceae)水蕨属(Ceratopteris)植物为一年生水生和沼生的同型孢子蕨类,遍布世界热带、亚热带以及温带地区。水蕨属植物在中国的分布共有两种：水蕨(C.thalictroides)和粗梗水蕨(C.pteridoides)。水蕨主要分布于华南、华东、华中、西南、台湾等热带和亚热带地区的池塘、湖泊、水沟、水田、沼泽和湿地中。近年来,由于人类活动对水生生境的影响,水蕨在我国的分布范围及其种群数量大大减少。该种已被列为国家二级重点保护野生植物。开展该濒危植物的保护生物学已迫在眉睫。由于水蕨的形态具有高度的可塑性,到目前为止对水蕨的物种的鉴定仍存在较大分歧。近年来,日本的学者采用细胞学、等位酶电泳、人工杂交实验以及利用叶绿体基因组DNA测序等方法对分布于日本的水蕨进行了分类学研究,结果显示分布于日本的水蕨至少包含着3个隐种,称为“南方型”("the south type"),“北方型”("the north type")和“第三型”("the third type")。目前,在中国有关水蕨的研究主要涉及孢粉学、生殖发育、生态学、保护遗传学等方面。尽管这些努力为水蕨的保护提供了资料,但这些研究均没有深入涉及到该濒危种的物种分类地位。中国的水蕨与日本的水蕨同为东亚分布,中国分布的水蕨是否也存在不同的隐种?另外,先前对水蕨进行的保护遗传学研究中对其遗传变异的评估也只在部分居群中进行。随着近一步深入全面的野外调查,获得了一些先前未曾开展过居群遗传变异研究的新的居群,这些居群的遗传变异模式又如何?只有对以上问题进行详细的研究,彻底弄清分布于中国的水蕨的物种分类状态及提供更全面的水蕨居群遗传学信息,我们才有可能采取更为有效的措施对该濒危植物进行保护。分子谱系地理学基于整合理论以及网络分支分析方法,能准确、有效地检测居群动态,扩散模式和同域物种分化过程等。在有关隐种的多样性及系统发育分析中分子谱系地理学也渐渐得到广泛的应用。为了弄清水蕨的分类状况及其居群遗传学特征,本研究首先通过与分布于日本的水蕨进行比较对中国的水蕨进行分子系统学分析来鉴定隐种的多样性,同时进一步采用分子谱系地理学的方法探讨中国水蕨的扩散机制及物种分化方式；先前对中国水蕨的代表居群进行的遗传多样性分析,所采用的分子标记都为显性标记,考虑到所采用的分子标记的局限性,本文开发一套适合研究水蕨居群遗传变异的共显性的SSR分子标记；基于所开发的SSR分子标记研究目前所发现的所有水蕨居群的遗传变异及其地理分布模式,为科学合理地制定水蕨的保护措施提供了理论依据。主要研究结果如下：(1)对目前在中国所发现的所有24个水蕨居群中的代表材料共143个个体进行了叶绿体基因组四个非编码区(trnL (UAA)-trnF (GAA), psbC-trnS (UGA), trnW (CCA)-trnP (UGG)和rbcL-atpB)的PCR扩增及测序实验,共获得19个叶绿体基因组单倍型；将本文所测的DNA序列与文献中报道的DNA序列相结合,采用与Masuyama et al. (2002)文献中相同的分子系统学分析方法,对分布于中国的水蕨隐种进行了鉴定。通过分子系统发育分析的聚类结果,判断中国的水蕨与日本学者报道的三个水蕨隐种中的两个(“南方型”和“北方型”)亲缘关系较近,推断中国存在两个水蕨隐种并且认为中国不存在新的隐种及不存在日本学者报道的第三个水蕨隐种(“第三类型“)。在中国分布于海南两居群为单一隐种(“南方型”),而分布于中国的其他居群为另外一个隐种(“北方型”)。通过对24个居群143份水蕨样品进行的四个叶绿体非编码区的测序,共获得19个单倍型,单倍型的网络图(MSN)显示单倍型分两组,其中14个单倍型为一组,对应隐种“北方型”；另外5个单倍型为一组,对应隐种“南方型”。PERMUT软件分析结果显示中国水蕨居群存在明显的地理结构(NST= 0.768> GST= 0.434, P< 0.05)。 AMOVA分析结果显示此组间的变异占绝大部分(91.8%),而组内居群间及居群内的变异仅分别占0.9%和7.3%。因此,中国水蕨样品中仅存在两个隐种。对于隐种“北方型”,其中一个单倍型广泛分布,而其它单倍型中多为居群特有,表明扩散可能是造成目前中国水蕨分布格局的主要原因。通过与国外已报道的水蕨叶绿体单倍型地理分布的比较,可以认为中国水蕨隐种“北方型”很可能来自印度尼西亚等地,经由台湾岛扩散至中国的热带及亚热带地区。对于隐种“南方型”,单倍型的分布和隐种“北方型”类似,也很可能起源于印度尼西亚等地,但却是经由海南岛扩散至中国广东等地。(2)采用限制位点相关DNA测序技术(RAD-seq测序)对来自于武汉植物园中的1个水蕨栽培样品进行了高通量测序,共获得450M的小DNA片段(reads)。采用软件MIS A (MIcro SAtellite identification tool)对测序的结果进行SSR鉴定,共鉴定出650个微卫星位点；利用软件Primer3对鉴定出的SSR进行引物的设计,共成功设计出285对SSR引物。随机选取60对所设计的引物对来自6个不同居群共6个水蕨样品进行了扩增效率检验,结果共获得8对条带清晰、具多态性且重复性好的SSR引物(名称：Cerl-Cer8)。然后,采用这8对SSR引物对广西百色居群和广东的英德居群两居群共26株植物进行居群遗传多样性分析。每一对引物在26株植物中的扩增结果显示,所得到的等位基因(NA)数范围在4-8之间；期待杂合子(HE)和Shannon-Wiener指数(H’)的范围分别为0.438-0.814和0.676-1.828,结果表明这8对SSR引物在水蕨代表性植株中展现出较高的遗传多态性,这些引物可以进一步应用到水蕨大规模的居群遗传多样性及居群遗传结构中。本文所开发的这些SSR引物能为日渐濒危的中国及其周边国家的水蕨的保护遗传学研究提供有效的工具。(3)采用6对本研究刚开发的微卫星引物(Cerl-Cer6)对来自中国目前所发现的24个水蕨自然居群中的229个样品进行了遗传多样性及居群遗传结构研究。由于水蕨为异源四倍体物种,本研究采用两种方法来运算基于SSR分子标记所获得的居群遗传学数据。一种方法是采用软件ATETRA对水蕨居群中所有可能的等位基因进行计算。另一种方法是将水蕨每一个体每一等位基因位点的等位基因记为“存在”和“缺失”两种状态,采用很多研究中常使用的软件GenAIEx。在本研究中,基于不同的软件、采用不同的SSR分子标记数据处理方法对水蕨的分析都表明水蕨居群的遗传变异主要存在于区域间,即与先前采用cpDNA非编码区序列所揭示的两个水蕨隐种“南方型”(居群SY、YC和HP)和“北方型”(其它21居群)在其分布区间的分化模式相一致。例如：24个水蕨居群间的遗传分化分析表明居群SY、YC和HP与其余21居群的遗传分化最大；AMOVA分析表明水蕨多数的遗传变异存在区域间(62%)；采用邻接法所构建的24个水蕨居群的系统关系表明居群SY、YC和HP与其它绝大多数的居群具有显著的分化；PCoA分析也表明居群SY、YC和HP聚成一组,而与其它居群分化明显。因此,本文基于核基因组SSR分子标记的研究结果也支持中国水蕨中存在两个遗传分化明显的隐种。ATETRA软件所运算的结果表明水蕨各隐种居群内具有较多的等位基因数,Shannon-Wiener多样性指数也显示水蕨居群内的基因多样性水平较高(范围从0.842至1.427)。较高的等位基因多样性水平可能是因为水蕨的异源四倍体特性,其基因组是通过两个不同的基因组杂合后加倍而来,水蕨居群保留了两个亲本种基因组中不同的等位基因。但采用GenAIEx软件所得到的结果显示水蕨居群内遗传多样性水平较低(PPL变化范围从4.05%至39.19%)。尽管采用不同软件及不同的数据处理方法对水蕨居群内的遗传多样性的评估结果存在差异性,值得进一步深入研究,但不同的处理方法却在水蕨居群的遗传分化研究中得出了相一致的结论,即所研究的24水蕨居群中,遗传变异的主要来源在于两个隐种之间,而在每个隐种内居群间遗传分化却较小。居群间较低的遗传变异很可能由于水蕨居群规模减小和居群隔离的时间较短,尽管当前居群间的基因流发生的可能性较小,但在早期水蕨居群未片段化时的基因流在其居群遗传多样性的产生和维持中扮演了重要作用。另外,由于水蕨具有一定的克隆繁殖特性,这很可能已帮助当前的水蕨植物固定了先前居群中存在的遗传多样性,阻止了水蕨居群的快速遗传漂变。基于以上研究结果,我们建议在对中国分布的水蕨植物进行保护的过程中,要将其两个隐种视为不同的进化单元分别采取措施进行保护；尽管目前水蕨不同隐种其居群内存在较多的等位基因以及居群间的分化较小,但随着时间的推移和居群规模的进一步减小,小居群效应,如遗传漂变和近交等,将会减少居群内遗传多样性及增加居群遗传分化,因此,在水蕨的保护中仍需重视小居群的遗传学后果。鉴于人为活动导致的水蕨适生生境的破坏和消失是造成水蕨濒危的主要原因,因此,保护该濒危水生蕨类植物其最重要的工作就是保护水蕨的适生生境免受破坏并促进居群的恢复。