论文部分内容阅读
目的分离培养牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLF)利用紫外可见分光光度计测量细菌浓度,将牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)活菌制备成109、108.107、106、105CFU/ml悬液,体外感染PDLF 6小时后检测细胞活性、炎性因子和骨代谢相关基因的表达,研究不同浓度P.gingivalis对PDLF的细胞活性、炎性因子和骨代谢相关基因表达的影响。方法利用组织块法分离培养PDLF,胰酶消化传代培养至第3--4代备用。P.gingivalis活菌在4℃条件下4000 r/min离心5分钟,弃去培养基,PBS缓冲液冲洗、4℃条件下4000 r/min离心5分钟,重复2次后,PBS缓冲液重悬,利用紫外可见分光光度计测量活菌悬液的浓度,当OD660=0.8时,细菌浓度为109 CFU/ml。将此活菌悬液于4℃条件下4000 r/min离心5分钟,弃去上清PBS缓冲液,加入等量不含双抗的DMEM培养基重悬,制成109CFU/ml的P. gingivalis活菌DMEM培养基悬液。将此悬液用不含双抗的DMEM培养基稀释分别成浓度为108、107、106、105CFU/ml的悬液。将P. gingivalis活菌分别以109、108、107、106、105CFU/ml浓感染PDLF 6小时,于倒置相差显微镜下观察细胞形态,台盼蓝染色检测细胞活性,实时荧光定量PCR检测细胞白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、骨保护素(osteoprotegerin, OPG)、RANKL和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)的基因表达。结果P. gingivalis活菌感染PDLF 6小时后,倒置相差显微镜下观察,细胞形态呈梭形或多角形。当细菌浓度达到109 CFU/ml时,肉眼观察可见培养基浑浊,倒置相差显微镜下观察,细胞形态不规则,胞膜不完整,胞核不清晰。台盼蓝染色结果显示与对照组相比,P. gingivalis活菌感染PDLF6小时后,细胞活率均下降,随着细菌浓度的升高,细胞活率逐渐下降,但差异无统计学意义。当P. gingivalis活菌浓度从105CFU/ml升高至109CFU/ml时,促炎细胞因子IL-6.IL-1β、TNF-α和RANKL的mRNA相对表达量均升高。对照组相比,P. gingivalis浓度达到108CFU/ml时,IL-6的mRNA相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01),P.gingivalis活菌浓度达到109 CFU/ml时,IL-1β、TNF-α的mRNA相对表达量升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。P.gingivalis活菌感染PDLF6小时后趋化因子IL-8的mRNA相对表达量升高,当P. gingivalis活菌浓度达到107 CFU/ml时,差异有统计学意义(P<0.01)。此外,P. gingivalis活菌浓度从105 CFU/ml升高至109 CFU/ml, RANKL的mRNA相对表达量亦升高,于108 CFU/ml时相对表达量最高,但与对照组相比差异无统计学意义。P. gingivalis活菌感染PDLF 6 h后所有实验组OPG的mRNA表达均明显下降,差异有统计学意义(P<0.01),当P. gingivalis活菌浓度为109 CFU/ml时,OPG的mRNA相对表达量最低。结论P. gingivalis活菌感染PDLF6小时后,细胞活性无明显改变,P. gingivalis活菌可刺激PDLF产生一系列细胞因子,进而参与牙周组织的破坏与改建。