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丙型肝炎病毒(HCV)是全球分布的重要病原体。急性HCV感染者约80%将转为持续性感染,且是引起肝硬化或肝癌的主要因素。HCV归属于黄病毒科(Flaviviridae family)的嗜肝病毒属,该病毒拥有约9.5 kb的正单链RNA基因组,含一个连续的开放读码框,可编码一种多聚前蛋白,由宿主和病毒的蛋白酶对此多聚前蛋白共同加工形成HCV病毒蛋白,包括位于N端的结构蛋白(structural protein)和位于C端的非结构蛋白(non-structural protein, NS)。HCV在复制过程中易发生变异,按其基因组序列异质性程度高低可分基因型(30%)、亚型(20%)及分离株(10%)。与其他RNA病毒一样,HCV最突出的变异,是多种相互密切关联而各不相同的病毒共存于同一宿主,称为准种(quasispecies)。HCV准种因能引起免疫逃避,导致HCV感染慢性化和影响干扰素治疗效果等,而成为当前的研究热点。 有关准种的研究近年来报道很多,但大多集中于HCV基因组变异最大的包膜2区(E2)N端的高度变异1区(HVR1)。研究表明,HVR1免疫逃逸株产生与病毒持续性感染有关。然而,研究证实,HCV异质性分布在整个基因组范围。持续性感染的HCV结构区可能还存在更多的有意义的变异区或位点。此外,准种研究的传统手段是分子克隆目标基因的PCR产物,并对每个克隆进行序列分析。要准确评估血标本中HCV准种的差异性,必须对大量克隆进行测序,但由于工作量大及开支高的原因,大多研究者仅对每例标本中的少量克隆进行测序。 本研究针对当前有关研究之不足,以急性HCV感染的两种转归即一过性及持续性感染者为对象,采用PCR扩增HCV结构区包括C区C端、 EI和EZ区N端长约 Ikb片段,并进行克隆,以单链构象多态性kingle strand conformatlon polymorphism,SSCP)/异质性双体(heteroduplex,HD)分析为 准种筛选方法,分析了准种复杂性,并对所选的代表性准种进行核酸序列 分析及结构蛋白表达,以了解准种演变进化概貌及其与病情转归的关系。 1.HCV结构区基因的扩增及克隆 以5’NCR的限制性长度多态性分析为基因分型方法,采用混合碱基设 计的通用引物一次性扩增了 HCV la、fo及 3b型的 C肥用 区长约 Ikb片 断,以此提高准种检测的灵敏度。利用TA克隆载体PT-AdV对结构区基因 的P*R产物进行克隆,使克隆效率>90%。 2.HCV结构区准种的忧化筛选 选通过较长PCR扩增HCV结构区长约Ikb片断,继而分两组PCR 扩增 C/EI区 (47 hp)和 EZ/HVRI区 (57 hp),每仔病人随机选取一个克 隆的C/EI或EZ区扩增产物作为驱动子*river卜 以SSCP用D方法对每份 标本的33个克隆的C用吧 区克隆型(准种)进行筛选。结果显示,每例 病人不同时相标本的EI 区克隆型存在廷续性;一过性感染者受感初期与 病毒清除前的EZ区优势克隆型虽不同,但未出现新的克隆型,而持续性感 染者急性期与漫性期血中的克隆型组成发生明显变化,并出现新的克隆型, 导致准种复杂性明显增加。 3.HCV准种的演变与急性感染的转归 对HCV一过性感染和持续性感染者不同时间标本的SSCP/HD优势克 隆型及劣势克隆型进行测序,通过序列差异性分析,观察HVRI及其他结 构区准种的演变状况;经第一时相对其他时相核酸序列的非同义碱基替换 和同义碱基替换率测定,进一步分析正性选择作用对准种演化的影响。结 果显示,持续性感染者中HVRI序列差异性明显增大,而一过性感染者则 无明显改变,两者的N及HVRI以外的EZ区序列差异性亦无明显差异, 表明一过性和持续性感染显示的准种演变形式不同主要由 HVR 变异所 致;持续性感染者HVRI的每月平均非同义碱基替换数呈增高趋势,两组 病人的m区和除外HVRI的EZ区*02个氨基酸残基)平均非同义碱基 ·IX· 、替换数却保持低水平,相反,两组病人EI、HVRI及HVRI以外EZ区的每月平均同义碱基替换数无显著差别,提示宿主兔疫压力主要对HVRI产生阳性选择作用。 4.HCV准种的系统发育 对 EZ区序列的系统进化树分析显示,HCV 3b型重庆株与欧洲株的序列差异较小,而比* 型各分离株间的序列差异较大;在持续性感染者中,HCV 3b型毒株的同义碱基替换率明显低于 la及几型毒株。这提示HCV不同亚型准种的演变程度有差异。 5.HOV结构蛋白在真核表达系统中的表达 将HCV C/EI/EZ基因长约Ikb片段亚克隆至哺乳动物表达载体,经大肠杆菌 DHS a扩增,在 TNT/T7兔网织红细胞裂解物中表达,表达的蛋白质分子量约57kDa。然而,随机逃?