鸡球虫病是由艾美耳球虫感染引起的寄生性原虫病,在全球范围内流行,给家禽养殖业造成重大的经济损失。基于药物防治诱发的耐药虫株和药物残留等问题,现阶段球虫病的防治开始逐渐由依靠化学药物转向免疫预防。球虫生活史复杂,不同发育阶段存在不同抗原,其中有性生殖阶段的配子体抗原,已被报道具有良好的免疫原性。本文克隆了柔嫩艾美耳球虫配子体抗原基因Etgam56,进行了基因序列分析,并对该基因所编码蛋白的特异性、抗原性、表达情况、虫体内定位、免疫保护效果等进行了分析,旨为球虫亚单位疫苗的研究奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫Etgam56基因的克隆与序列分析提取柔嫩艾美耳球虫（扬州株）配子体基因组DNA,PCR扩增Etgam56基因的全长为1425 bp,为一个完整阅读框,共编码474个氨基酸,预测蛋白大小为53.74 kDa,等电点（PI）为4.92,抗原决定簇在线软件预测该蛋白含有9个抗原决定簇,并含有一个丝氨酸和酪氨酸富集区和一个脯氨酸和甲硫氨酸富集区。与其他艾美耳球虫配子体基因序列比对结果显示,与毒害艾美耳球虫配子体基因Engam56的同源性最高,为87.9%。综合以上结果以及艾美耳球虫配子体基因高度保守的特点,证实本试验扩增的Etgam56基因为配子体蛋白编码基因。2.柔嫩艾美耳球虫Etgam56基因的原核表达和抗原性分析经克隆和序列分析后,去除信号肽,根据大肠杆菌的密码子偏嗜性优化基因序列,Etgam56基因连接至pET28a（+）,构建原核表达载体pET28a（+）-Etgam56,优化体外诱导表达条件,Western-blot分析重组蛋白抗原性。结果显示,体外表达重组蛋白的大小约为56 kDa,在0.10 mM IPTG,37℃,3h的诱导条件下表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在。该体外重组表达的蛋白能被6×HIS标签单克隆抗体、小鼠抗重组蛋白多克隆抗体、鸡柔嫩艾美耳球虫病康复血清和鸡毒害艾美耳球虫病康复血清识别,表明该重组蛋白为特异性表达的蛋白,具有很好的抗原性和交叉反应性。3.柔嫩艾美耳球虫Etgam56基因在不同发育阶段虫体内的表达与定位分析柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1×104个,经口感染4周龄无球虫感染的黄羽肉鸡,采集感染后 96 h、108 h、120 h、132 h、144 h、156 h、168 h、180 h、192 h 的盲肠组织,一部分用于提取总RNA并转录成cDNA,进行相对定量Real-time PCR;一部分用于制备石蜡切片,常规H.E.染色观察虫体的发育情况,同时,以鼠抗rEtGAM56多克隆抗体为一抗,以FITC标记的羊抗鼠IgG单抗为二抗,进行激光共聚焦免疫荧光定位分析,观察重组蛋白在虫体内的定位。试验结果显示,Etgam56基因在配子体阶段特异性表达,其编码的蛋白位于大配子体内的成壁体上,参与了卵囊壁的形成。4.柔嫩艾美耳球虫重组配子体蛋白rEtGAM56的免疫保护效果分析大量表达与纯化重组蛋白,设置三个不同剂量,免疫6日龄黄羽肉鸡,14日龄加强免疫一次,21日龄时每只鸡攻击1.0×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,通过平均增重、病变记分、卵囊产量等评价指标,对重组蛋白的免疫保护效果进行分析。结果显示,重组蛋白免疫的鸡群能够在一定程度上降低卵囊产量,盲肠病变等,综合分析显示200 μg/只重组蛋白免疫组的保护效果最佳。