研究背景：随着生活水平的提高,人工种植体的应用日趋广泛,人们对生物材料的安全性及生物活性有更高的要求。金属纯钛强度大,有良好的耐热性、耐低温性,弹性模量低,无磁性,无毒,生物相容性好,其合金有好的耐热强度、低温韧性和断裂韧性,因此,钛被广泛地应用于硬组织的修复和替换材料,成为首选的金属医用材料。但是钛自身缺乏骨诱导性能,与周围组织无强有力的机械结合,生物活性差,在机体环境下可被腐蚀,释放金属离子,这些都影响着钛种植体的稳定和长期成功率。随着近年来材料学的发展,钛表面处理技术一直是研究的热点和重点,如何通过材料表面处理获得更好的骨结合能力,缩短骨愈合时间成为众多学者的研究目标并获得了良好的效果。钛表面改性后,多数形成微粗糙或粗糙表面,这虽然有利于骨整合但是同时也更利于细菌的附着,而金属钛本身并不具备抗菌功能,因此在对钛表面进行生物活性改性的同时,对其进行抗菌改性有着重要意义。目前钛表面改性的方法主要有,等离子喷涂(plasma sprayed coating, PSC)、离子束辅助沉积(ion beam assisted deposition, IBAD)、脉冲激光沉积(pulsedlaser deposition, PLD)、仿生溶液生长法(biomimetic deposition)、溶胶-凝胶法(sol-gel processing)、碱热处理法(alkaline and heating treatment)、喷砂和酸蚀处理(sandblasted and acid-etching, SLA)、可吸收性研磨介质处理(resorbable blast media, RBM)、离子注入法(Ion implantation method)、激光轰击法(Laser ablation)以及微弧氧化(micro-arc oxidation, MAO)法等。微弧氧化法可在钛金属表面原位生成以钛金属为基体的陶瓷膜层,该膜层加强了钛表面的抗腐蚀性能,跟其他方法相比,微弧氧化法生成的膜层与基体的结合力更强,硬度更高。通过控制电解液的组分和浓度,还可在钛表面生成适当钙磷比的膜层。有研究报道通过该方法能在钛表面生成具有骨诱导性能的羟基磷灰石和具良好生物活性的金红石和锐钛矿型TiO2,从而促进骨结合,加快骨愈合。目前的抗菌材料中,银因具有杀菌广谱性,杀菌功能强大,不产生耐药性,对机体无毒性,杀菌作用持久等优点成为目前前景最广阔的抗菌材料。本实验通过在传统的含钙、磷盐的微弧氧化电解液中添加硝酸银成分,调控电解液中各组分的比例,制备含钙、磷、银的复合陶瓷膜层。该膜层在促进成骨细胞的粘附、增殖、分化,提高成骨细胞碱性磷酸酶活性的同时,还对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及牙龈卟啉单胞菌具备抗菌能力,这是传统微弧氧化膜层不具备的性能。目的：本课题通过研究钛表面含钙、磷、银复合陶瓷膜层的微弧氧化制备方法并进一步研究该膜层的表面特性、细胞生物活性及其抗菌性能,为在钛表面制备既具良好生物活性又具抗菌性能的复合膜层的研究提供理论依据。材料和方法：1.实验分三组,空白对照组为M组是机械打磨的钛样品,实验对照组为MAO组是传统钙、磷盐电解液配方制备的钛样品,实验组为MAO-Ag组是电解液中含钙盐、磷盐、硝酸银配方制备的钛样品。细胞实验使用规格为Φ15mmm,厚度1mm的圆形钛片；抗菌实验使用规格为23mm×23mm的正方形钛片,厚度为1mm。各组钛片制备好后常温下自然干燥,进行理化性能的检测,包括扫描电子显微镜(SEM)观察表面形貌,表面轮廓仪测量其粗糙度,表面接触角测试仪测量静态水接触角,X射线能量色散谱仪(EDS)对其进行表面元素成分及含量分析,X射线衍射仪(XRD)对其表面元素的存在形式进行分析。2.人成骨肉瘤细胞系MG63细胞及ATCC成纤维细胞分别接种于三组钛片的48h浸泡液中培养,24h后光镜观察细胞形态进行细胞毒性定性检测,MTS法进行定量检测细胞毒性3.人成骨肉瘤细胞系MG63接种于三组钛片表面,2h、4h、8h、24h后,将钛片进行扫描电镜前样品处理,于扫描电镜下观察细胞的粘附,伸展及分化的形态变化。用Hoechst33342染色剂对接种钛片上2h、4h、8h的细胞进行核染色,在荧光显微镜下拍摄图片,用IPP图像处理软件进行计数,计算其粘附率,比较各组钛片表面细胞的粘附水平。4.对接种于各组钛片上的人成骨肉瘤细胞系MG63细胞进行MTS法增殖检测及碱性磷酸酶(ALP)的检测。MTS检测增殖设置的时间点为细胞接种1d、3d、5d、7d,ALP检测设置的时间点为细胞接种后7d、14d、21d。5.抗菌实验采用贴膜法,按照GB/T21510-2008国家标准,定量检测各组钛片对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌的抗菌性能。6.以上细胞实验每个时间段每个处理组均设6个样本,每个样本重复3次测量。贴膜法抗菌实验按照国家标准每组设3个样本,洗脱液梯度稀释,每个梯度设置2个平行样本,实验重复3次,结果取平均值。所得数据数据以均数±标准差(X±S)表示,采用SPSS13.0数据处理软件分析,析因分析分析时间与处理因素之间的交互效应；多个样本均数比较采用单因素方差分析(one-Way ANOVA), Levene’s test检验方差齐性,方差齐则采用LSD样本均数间的两两比较,方差不齐则采用近似F检验的Welch方法进行方差分析,Dunnett’s T3多重比较。假设检验为双侧检验,检验标准0.05,P<0.05时差异有统计学意义。实验结果：1.经扫描电镜观察M组钛片呈方向一致的沟槽状划痕；MAO组及MAO-Ag组呈现均匀分布的大小不一的火山丘状微孔,孔隙大小约1-5μm；MAO-Ag组和MAO组之间形貌并无差别。经微弧氧化处理后,钛片表面粗糙度值Ra增高,但MAO-Ag组和MAO组之间并无差异,Ra值结果为MAO-Ag组=MAO组>M组。表面接触角测量结果为MAO-Ag组=MAO组<M组。EDS结果显示,M组表面只存在Ti元素,MAO组表面含Ti、Ca、P、O四种元素,MAO-Ag组表面含Ti、Ca、P、O、Ag五种元素。XRD分析表面元素存在形式,发现MAO-Ag组和MAO组表面均生成锐钛矿和金红石型Ti02,且MAO-Ag组出现银元素的衍射峰。理化性能检测表明,微弧氧化处理改变了纯钛表面形貌、粗糙度、接触角以及表面化学成分；通过微弧氧化可在钛表面生成生物活性良好的金红石和锐钛矿型Ti02,且将钙、磷、银元素载入钛表面氧化膜层；电解液中添加硝酸银成分并未造成两组微弧氧化膜层的物理性能差异,只在元素种类及含量上有差异。2.细胞毒性检测结果示三组钛片48h浸泡液培养的ATCC成纤维细胞及MG63细胞形态正常,生长良好,而含苯酚的阳性对照组中的细胞则出现细胞圆缩死亡,细胞内泡性变；MTS定量检测细胞毒性结果示三组钛片的细胞毒性均为0级,含苯酚的阳性对照组细胞毒性为3级毒性,说明在钛表面载入微量的银对细胞无毒性。3.SEM观察示接种于MAO-Ag组和MAO组表面的MG63细胞粘附、伸展及分化水平在2h、4h、8h、24h四个时间段均优于M组表面的MG63细胞；在同一时间点上,MAO-Ag组和MAO组表面粘附更多细胞,且细胞的伸展范围较M组大；24h时MAO-Ag组和MAO组表面可见比M组更多的新增殖细胞及分裂中细胞。粘附率检测结果示2h、4h时,MAO-Ag组和MAO组表面细胞粘附率高于M组,8h时三组之间无明显差异。三组钛片表面细胞粘附率呈时间依赖性逐渐上升,MAO-Ag组和MAO组钛片促进MG63细胞的早期粘附。4.MTS增殖检测结果示1d、3d、5d、7d四个时间点的OD值均呈现MAO-Ag组=MAO组>M组,且在设置的时间点内随着时间的推移,各组的OD值增大,说明MAO-Ag组和MAO组钛片均能促进成骨细胞的增殖。ALP检测结果示7d、14d、21d三个时间点的OD值均呈现MAO-Ag组=MAO组>M组,且各组的OD值在14d最高。微弧氧化改性后的MAO-Ag组和MAO组钛片表现比未经表面处理的M组更优异的生物活性。5.贴膜法抗菌实验结果显示接种24h后,平板计数显示M组及MAO组钛片表面三种细菌均出现繁殖,而MAO-Ag组的钛片则对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌抗菌率均达99.9%。MAO-Ag组对牙龈卟啉单胞菌表现了良好的抗菌性能。结论：1.通过微弧氧化法可以在纯钛表面制备载钙、磷、银复合陶瓷膜层。且该膜层的表面形貌及物理性能与含钙、磷电解液中制备的微弧氧化膜层一致,均增高了钛表面粗糙度及亲水性,表面均生成锐钛矿和金红石型的Ti02。2.微弧氧化法制备的载钙、磷、银复合陶瓷膜层具备良好的生物安全性,对人成骨肉瘤细胞系MG63细胞及ATCC成纤维细胞无细胞毒性。能促进MG63细胞在其表面粘附、伸展、分化；促进MG63细胞的早期粘附,细胞的粘附率呈时间依赖性,随着时间的推移而增大；能在1d、3d、5d、7d内促进MG63细胞增殖,在测试的时间内其表面细胞增殖活性随时间的增加而增高；在MAO-Ag组表现出比M组更高的ALP活性,在测试时间内ALP活性在14d达到高峰,该膜层能促进成骨细胞ALP合成。3.本实验制备的载钙、磷、银微弧氧化陶瓷膜层在表现优异的生物学活性的同时具备良好的抗菌功能,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌均有良好的抗菌功能,这是载钙、磷微弧氧陶瓷膜层不具备的功能。