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肠道是机体接触外源微生物、毒素和其他抗原物质的主要场所;正常情况下,外源有毒有害物质受到肠粘膜屏障的阻隔无法通过肠腔进入机体内部从而产生影响;一旦肠粘膜屏障受到损害将导致肠道功能异常,不同程度危及机体健康。牛乳铁蛋白肽(lactoferricin bovine,LfcinB)是牛乳铁蛋白在胃蛋白酶作用下酶解得到的一段含25个氨基酸残基的多肽,其具有抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长以及免疫调节等生理功能。目前对于LfcinB是否能通过改善肠粘膜屏障功能来维护肠道健康尚未见详细报道。本研究基于肠粘膜屏障损伤的动物模型(含5%葡聚糖硫酸钠饮水造模,5%DSS)和肠道类器官(organoid)模型,探讨LfcinB在体内外条件下对肠粘膜屏障的保护功能及相关机制。主要研究内容及结果如下:(1)LfcinB对肠粘膜屏障的保护作用研究。利用动物模型研究了LfcinB对肠粘膜机械、免疫、化学和微生物屏障的影响;实验设对照C组、DSS组(5%DSS)、LfcinB组(5 mg/kg LfcinB),LBD组(DSS+LfcinB);实验结果表明,LfcinB能够显著降低疾病活动指数(Disease activity index DAI)和二胺氧化酶(DAO)含量(p<0.05),减轻肠炎大鼠肠粘膜机械屏障损伤;肠组织切片结果显示LfcinB改善了肠炎大鼠的肠道紧密连接破坏、微绒毛损失、肠上皮层广泛溃疡、水肿、隐窝损伤、炎性细胞浸润等炎症现象,能够维持肠组织形态的完整;且LfcinB显著缓解了肠炎大鼠粘液分泌减少和炎性浸润现象。结肠微生物16S rRNA基因序列分析揭示LfcinB改善了肠炎大鼠微生物物种丰富度和多样性的显著降低(p<0.05),使肠道菌群群落结构更加趋近于正常大鼠,且使瘤胃球菌等产短链脂肪酸(Short chain Fatty Acid,SCFA)有益菌的菌群丰度增加了27%。以上结果说明LfcinB可以从改善肠组织形态、粘液分泌、巨噬细胞浸润和调控微生物区系分布等方面减轻肠粘膜屏障损伤,维持肠道健康。(2)LfcinB保护肠粘膜屏障的可能机制探讨。对大鼠结肠组织中紧密连接蛋白、杯状细胞分泌的粘蛋白(Muc2)和肠三叶因子(TFF3)表达水平分析结果显示,LfcinB改善了肠道炎症导致的ZO-1、Occludin、Muc2、TFF3表达异常,使Muc2和TFF3的mRNA表达量分别呈5.6倍和4.6倍增加;LfcinB降低了结肠炎大鼠结肠组织中IgA和髓过氧化物酶(MPO)含量(p<0.05),通过NF-κB/NLRP3信号通路的调控使肠炎大鼠结肠组织中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表达量分别降低了1.9倍、1.6倍、1.3倍(p<0.05),进而抑制了炎症的发生和发展,实现保护肠粘膜屏障功能。(3)LfcinB的体外模拟消化及消化产物(短肽)对肠道细胞的损伤修复作用初探。体外模拟胃消化结果揭示,LfcinB经胃消化后主要产生了以MT10(Met-lys-lys-leu-glyAla-pro-ser-Ile-Thr)为主的短肽。利用肠道类器官模型进一步研究了MT10对TNF-α炎性损伤的organoid增殖分化的影响;实验设对照组C、TNF-α组(200 ng/mL)、MT10组(1μg/mL),MT10+TNF-α组。对organoid内细胞增殖和分化的分析结果表明MT10能够预防organoid的异常增殖,改善organoid分化失衡(p<0.01)。对紧密连接蛋白ZO-1表达水平及分布的分析表明了MT10能够缓解TNF-α对organoid紧密连接蛋白结构的破坏。上述结果揭示LfcinB在经胃消化后产生的主要产物MT10可以预防TNF-α对organoid炎性损伤,维持肠道organoid细胞稳定生长。综上所述,LfcinB能够显著缓解DSS对肠炎大鼠结肠组织的破坏,其作用机制可能是通过改善紧密连接蛋白、粘蛋白的表达修复肠粘膜物理和化学屏障,通过NF-κB/NLRP3信号通路调控炎因子的表达和分泌来抑制肠道炎症,缓解肠组织炎性浸润,增加有益菌菌群丰度等来实现对肠粘膜屏障的保护作用。体外模拟消化和类器官模型研究结果揭示了这种保护作用可能与LfcinB胃消化产物MT10对organoid细胞异常增殖分化的调节和对紧密连接蛋白表达分布的改善作用密切相关。