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一、目的糖基化修饰,是常见的蛋白质翻译后修饰方式之一,这些通过有机和无机基团共价加成的蛋白质修饰可以发生在哺乳动物细胞中几乎所有已知的蛋白质上,它们代表一种精细的调控机制,将DNA的遗传信息由线性扩展到三维结构的全景图中。由于所连接的糖链结构不同,糖基化可分为N-糖基化、O-糖基化、C-甘露糖化和糖基磷脂酰肌醇锚定糖基化。蛋白质的糖基化可改变肽链的空间结构与稳定性,从而对细胞生物学功能产生影响,包括糖蛋白的转运、细胞信号的传递、细胞之间的识别与黏附等等。目前已有诸多研究发现在与肿瘤相关的表观遗传学改变中,糖基化的改变不仅直接影响肿瘤细胞的生长存活及侵袭转移,而且促进肿瘤诱导的免疫调节和最终的转移。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种N-结合糖蛋白家族的分泌型磷酸化糖蛋白,其结构中包含N-糖基化位点和O-糖基化位点。OPN通过与细胞表面的整合素受体相互作用可调节细胞之间的黏附、细胞迁移、细胞基质间相互作用,参与机体发育及某些病理过程,与肿瘤细胞的增殖及迁移侵袭密切相关,而这些功能在很大程度上依赖于蛋白的翻译后修饰过程。但关于OPN N-糖基化修饰在生殖过程中的作用尚不明确。本研究选择人子宫内膜癌细胞系(RL95-2细胞、HEC-1A细胞)分别模拟高低接受状态的子宫内膜,构建OPN-N糖基化突变质粒后转染上述两种子宫内膜癌细胞系后通过CCK-8实验、克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验检测N-糖基化修饰对高低接受状态的子宫内膜细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。通过western blot实验进一步研究OPN-N糖基化修饰对子宫内膜接受状态调控的分子机制。二、方法1、选择RL95-2细胞、HEC-1A细胞模拟高、低接受状态的子宫内膜;2、选用凝集素ConA进行Lectin blot实验检测高低接受状态子宫内膜细胞内的N-糖基化水平;3、用衣霉素处理RL95-2细胞、HEC-1A细胞,模拟去N-糖基化修饰模型;4、构建OPN-N糖基化突变质粒后转染上述两种子宫内膜癌细胞系;5、通过细胞免疫荧光及western blot实验,确定N-糖基化修饰对蛋白定位及本身性质的影响;6、通过CCK-8实验、克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验检测N-糖基化修饰对细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响;7、通过western blot实验进一步研究OPN-N糖基化修饰对子宫内膜接受状态调控的分子机制。三、结果1、RL95-2细胞的N-糖基化水平高于HEC-1A细胞;2、衣霉素抑制子宫内膜癌细胞内蛋白质的N-糖基化水平;3、OPN N-糖基化修饰不影响OPN在细胞内的定位;4、OPN N-糖基化修饰促进RL95-2细胞的增殖能力;5、OPN N-糖基化修饰促进RL95-2细胞、HEC-1A细胞的迁移及侵袭能力;6、MAPK/ERK和PI3K/Akt通路参与OPN N-糖基化修饰调节子宫内膜细胞的迁移和侵袭。四、结论1、OPN N-糖基化修饰促进RL95-2细胞、HEC-1A细胞的迁移及侵袭能力;2、OPN N-糖基化修饰通过激活MAPK/ERK参与转录因子Snail调节E-cadherin、Vimentin表达促进RL95-2细胞、HEC-1A细胞的上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)过程;3、OPN N-糖基化修饰通过激活PI3K/Akt参与转录因子β-catenin调节MMP-2/9表达促进RL95-2细胞、HEC-1A细胞的黏附从而调节其迁移侵袭过程。