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目的:急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)的发生发展是多因素共同介导的多步骤过程,涉及多种调控分子改变。其中,遗传学畸变,包括染色体数目和/或结构异常、重现性基因突变或缺失等,相互作用、协同驱动AML的产生,同时也是影响患者临床预后的重要因素。目前AML中这些已知的遗传分子改变被广泛应用于区分疾病分型、指导个性化治疗以及评估预后风险,使得患者的五年生存率有了显著提升。但是,仍然有部分患者预后不良;特别的是,相同遗传亚型患者的治疗效果和临床结局也并非一致,提示这些病例可能伴有至今还未被发现的分子水平异常。因此,更进一步探究疾病发生发展的机制,挖掘新的关键调控分子对提高AML的疗效与长期生存率至关重要。90%的人类基因组DNA转录为非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),其中转录本长度超出200个核苷酸者被归类为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),因其开放阅读框架长度不足而不能编码蛋白或编码能力极低。lncRNA的表达存在组织特异性与时间空间特异性,在细胞核和细胞浆中均有分布,可与DNA分子、RNA分子和蛋白质相互结合互相作用,从表观遗传学水平、转录水平和转录后水平等层面调节靶基因表达,在物种进化、生物体发育和衰老、细胞稳态维系、物质代谢和疾病发生发展等众多生理病理进程中扮演重要角色。在造血系统中,lncRNA能够维持干细胞的自我更新,促进造血细胞的定向分化与成熟,参与造血免疫系统的发育和激活。近年来,越来越多的研究发现AML中存在特定lncRNA表达异常。这些lncRNA在AML中发挥近似原癌基因或抑癌基因的作用,与疾病的启动、维持、发展及复发密切相关,更有文献报道lncRNA还参与AML细胞对化疗敏感或耐药的发生。深入研究lncRNA,为理解AML的本质提供全新视野,有利于理清AML发病和治疗的分子调控机制,为疾病诊断、靶向治疗和预后评估提供新的思路。同源盒基因(homeobox gene,HOX)是造血干/祖细胞分化成熟的主控基因,在正常造血过程中不可或缺,其表达异常可导致白血病的发生与发展。研究发现大量lncRNA位于HOX基因簇中或与之相关,包括HOTAIR、HOTAIRM1和HOTTIP等。HOX基因簇lncRNA在AML的恶性进程中起至关重要的调控作用,影响细胞增殖、分化、周期和凋亡等生物学行为。临床上,HOX基因簇lnc RNA被证实与AML患者诊断分型和生存结局有明确的关联性,可作为有效的生物学标志指导治疗和评估预后。HOXA-AS2是长度为1048个核苷酸,定位于7号染色体长臂1区5带7q15.1,处于HOXA3和HOXA4基因间的反义lncRNA。研究显示HOXA-AS2在多种恶性实体肿瘤中异常高表达,与肿瘤的发病、侵袭、转移及预后关系密切。在实体种瘤中,HOXA-AS2可通过调节组蛋白修饰、作为分子海绵吸附抑制mi RNA表达等方式发挥促癌功能。但是在AML中,HOXA-AS2的表达、临床意义、生物学功能及分子作用机制尚不清楚。鉴于此,本研究旨在检测HOXA-AS2在急性髓系白血病中的表达情况,分析其表达水平与患者临床资料的相关性及意义,研究HOXA-AS2对人髓系白血病细胞株生物学行为的影响,探索HOXA-AS2在AML中作用的下游目的基因及调控分子机制,为AML的诊疗提供全新的的生物学标志物及相应的实验理论基础。研究方法:1.收集初治成人AML患者108例、非恶性血液病对照者36例的骨髓标本,免疫磁珠分选法分离6例健康产妇脐血CD34阳性细胞标本,qRT-PCR实验检测HOXA-AS2的表达差异,分析研究HOXA-AS2表达水平与AML患者临床分型、实验室指标、疗效和长期生存等参数的相关性。2.HOXA-AS2的体外功能研究:培养人髓系白血病细胞株,qRT-PCR实验检测各细胞株内源性HOXA-AS2的表达,选用相对高水平表达HOXA-AS2的细胞株,感染慢病毒介导的靶向HOXA-AS2的shRNA以下调其表达水平,应用CCK-8、流式细胞术、EdU染色、Hoechst染色、Western-blot等实验观察敲减HOXA-AS2对人髓系白血病细胞增殖、分化、周期及凋亡等生物学行为的影响。3.HOXA-AS2调控的分子机制研究:核质分离结合qRT-PCR实验明确HOXAAS2在人髓系白血病细胞中的亚细胞定位;qRT-PCR和Western Blot实验检测敲减HOXA-AS2后邻近基因HOXA3、HOXA4表达的改变;通过文献检索推测HOXAAS2可能通过PI3K/AKT信号通路发挥作用,SOX4是HOXA-AS2潜在靶基因之一,Western Blot实验检测敲减HOXA-AS2后PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的改变;qRT-PCR和Western Blot实验检测敲减HOXA-AS2后SOX4表达的变化;qRTPCR实验检测AML患者中SOX4和HOXA-AS2的表达关系;分别共转染shRNA control+vector、shRNA control+SOX4 OE、HOXA-AS2 shRNA+vector、HOXA-AS2shRNA+SOX4 OE质粒,应用CCK-8、流式细胞术、Western blot实验探索HOXA-AS2是否通过SOX4发挥作用;生物信息学预测能与HOXA-AS2和SOX4 3’UTR区共同结合的miR-124-3p,使用qRT-PCR实验检测敲减HOXA-AS2后miR-124-3p表达的改变;转染miR-NC及miR-124-3p mimic质粒,qRT-PCR和Western blot实验检测上调miR-124-3p表达后HOXA-AS2和SOX4表达的变化;qRT-PCR实验检测AML患者中miR-124-3p与HOXA-AS2、SOX4的表达关系;双荧光素酶报告基因实验明确miR-124-3p是否分别与HOXA-AS2和SOX4 3’UTR在相同的位点靶向结合;在已感染shRNA control和HOXA-AS2 shRNA的细胞株中再分别转染miRNC及miR-124-3p inhibitor质粒,qRT-PCR和Western Blot实验检测共转染各组中SOX4表达的变化;应用CCK-8实验、流式细胞术探索miR-124-3p在AML中的生物学作用;应用CCK-8、流式细胞术、Western blot实验研究HOXA-AS2和miR-124-3p、miR-124-3p和SOX4双重作用下髓系白血病细胞生物学行为的变化。4.细胞实验每组重复3次。所得实验数据应用GraphPad Prism 6.0和SPSS 22.0软件进行统计学分析,其中分类变量以率或构成比表示,差异分析使用卡方检验;连续变量使用Kolmogorov-Smirnov法检验数据分布正态性,正态分布的连续变量以均数±标准差表示,差异分析使?独?样本t检验,非正态分布的连续变量以中位数、四分位数间距表示,差异分析使用非参数秩和检验;生存分析使用KaplanMeier法,差异分析应用log-rank检验,多因素分析应用Cox回归模型;所有检验均为双侧检验,P值<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.HOXA-AS2在AML中的表达及临床意义1.1与非恶性血液病对照组和CD34阳性细胞组比较,初治AML患者中HOXAAS2的表达水平显著上调。1.2 HOXA-AS2的表达水平在FAB亚型、染色体核型分型与特征性基因突变类型中有所差异;AML患者中,高HOXA-AS2表达与高外周血白细胞计数、高骨髓原始细胞比例、微小残留病阳性、染色体预后危险分层高危以及早期死亡成正相关;AML患者获得完全缓解后HOXA-AS2的表达水平较初诊时明显下调;生存分析显示,高HOXA-AS2表达的AML患者总生存时间及无复发生存时间相对更短于HOXA-AS2低表达者,其中在染色体核型正常患者中,这种差异有统计学意义,进一步进行单因素和多因素分析发现高HOXA-AS2表达是染色体核型正常患者预后不佳的独立危险因素。2.HOXA-AS2对人髓系白血病细胞株生物学行为的影响2.1 HOXA-AS2在不同人髓系白血病细胞株中的表达水平较对照组均显著上调。2.2 HL-60和K562细胞株中内源性HOXA-AS2的表达水平相对更高,在这2株细胞系中感染3条不同的HOXA-AS2 shRNAs,其中HOXA-AS2 shRNA1和HOXA-AS2 shRNA2的敲减效率相对更高(敲减效率超过70%),在后续实验中应用此2条shRNAs。2.3 CCK-8实验结果显示HOXA-AS2敲减组的细胞增殖能力较阴性对照组和空白组显著减弱;Western Blot实验结果显示HOXA-AS2敲减组中增殖相关蛋白PCNA的表达水平较阴性对照组和空白组显著下调。2.4流式及EdU染色实验结果显示HOXA-AS2敲减组中细胞被阻滞于G0/G1期,进入S期的细胞比例较阴性对照组和空白组明显下调;Western Blot实验结果显示HOXA-AS2敲减组中周期调控相关蛋白cyclin D1及CDK4的表达较阴性对照组和空白组明显受抑制。2.5流式及Hoechst染色实验结果显示HOXA-AS2敲减组细胞凋亡比例较阴性对照组和空白组明显增加;Western Blot实验结果显示HOXA-AS2敲减组凋亡相关蛋白cleaved PARP、cleaved Caspase 3、cleaved Caspase 9和BAX蛋白表达水平较阴性对照组和空白组均显著上调,抗凋亡蛋白BCL2表达明显受抑制。2.6流式检测结果显示HOXA-AS2敲减组CD11b阳性细胞比例与阴性对照组和空白组比较未见明显差异。3.HOXA-AS2作用AML的分子机制研究3.1 HOXA-AS2在人髓系白血病细胞质和细胞核中均有表达,但主要表达于细胞质。3.2 HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后其邻近基因HOXA3和HOXA4的表达均无显著变化。3.3 HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后磷酸化PI3K、磷酸化AKT蛋白表达水平显著下调,P21和P27蛋白表达水平明显上调。HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后SOX4 mRNA和蛋白表达水平均明显下调;AML患者中SOX4显著高表达、且与HOXA-AS2的表达成正相关;过表达SOX4部分恢复敲减HOXA-AS2对HL-60和K562细胞增殖抑制、阻滞细胞周期于G0/G1期及诱导凋亡的作用。3.4 HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后miR-124-3p的表达显著上调;HL-60和K562细胞上调miR-124-3p的表达后显著降低HOXA-AS2的表达水平,SOX4的表达也受明显抑制;AML患者中miR-124-3p显著低表达且与HOXA-AS2和SOX4的表达成负相关;双荧光素酶报告基因实验证实miR-124-3p可分别与HOX-AS2和SOX4 3’UTR在相同位点靶向结合;同时敲减HOXA-AS2并下调miR-124-3p表达的髓系白血病细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达水平较单纯敲减HOXA-AS2细胞组显著降低,但明显高于单纯下调miR-124-3p表达细胞组。3.5 miR-124-3p在AML中起抑癌作用,上调miR-124-3p表达能够抑制HL-60和K562细胞增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期及诱导细胞凋亡,其生物学功能与敲减HOXA-AS2的趋势一致。3.6下调mi R-124-3p表达能够部分挽救敲减HOXA-AS2引起的HL-60和K562细胞增殖抑制、G0/G1期细胞阻滞及细胞凋亡增加,下调miR-124-3p表达所导致的促进髓系细胞白血病生长的作用也被HOXA-AS2 shRNA部分逆转。3.7过表达SOX4能够部分逆转上调miR-124-3p表达所引起的HL-60和K562细胞增殖抑制、周期阻滞于G0/G1期及诱导细胞凋亡的作用。结论:1.HOXA-AS2在急性髓系白血病患者中高表达,与反映病情严重的临床参数成正相关;高HOXA-AS2表达患者预后趋势不佳,在染色体核型正常患者中,HOXA-AS2高表达是预后不良的独立危险因素。2.HOXA-AS2在髓系白血病细胞系中高表达,起促癌作用,促进髓系白血病细胞增殖、抑制细胞凋亡,对细胞分化无显著影响。3.HOX-AS2靶向结合miR-124-3p,减弱其对SOX4的负性调控作用,从而促进髓系白血病细胞的生长。