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目的:初步探讨新疆部分地区结核分枝杆菌对链霉素耐药的机制,从分子水平上探讨链霉素耐药与rpsL和rrS基因突变之间的关系,给临床医师提供参考,以便合理选用药物,有效治疗病人,达到较好地控制新疆结核病流行的目的。
方法:本研究通过对门诊患者痰标本进行涂片抗酸染色检查、分离培养、菌株鉴定、四种一线抗结核药物(利福平、链霉素、异烟肼和乙胺丁醇)的药敏检测,筛选出耐链霉素及耐利福平、乙胺丁醇、异烟肼结核分枝杆菌菌株,获得结核分枝杆菌的耐药类型以及耐多药株的耐药谱。然后应用聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)分子生物学方法对结核分枝杆菌的rpsL和rrS基因进行检测,并将突变体进行分子克隆,结合DNA测序的结果,了解新疆部分地区患者结核分枝杆菌对链霉素的耐药分子机制。
结果:270份痰标本,痰涂片阳性(涂阳)75份,对所有涂阳标本进行分离培养,获得培养阳性菌株67株,药敏鉴定得到62株人型结核分枝杆菌、2株牛型结核分枝杆菌和3株非结核分枝杆菌,在62株人型结核分枝杆菌中,耐链霉素菌株30株,耐药率为48.4%。
将62株人型结核分枝杆菌的rpsL基因(267bp)和rrS基因(200bp)扩增产物进行SSCP分析,标准参考株H37Rv作为对照,32株敏感菌株rpsL基因和rrS基因的SSCP图谱均与标准参考株H37Rv相同,在30株耐药株中,23株耐药菌株的SSCP图谱均与标准参考株H37Rv不相同,其中,rpsL基因为21株和rrS基因为5株,并且3株出现了rpsL和rrS双基因的SSCP泳动异常。然后再将泳动异常的菌株测序,结果发现16株链霉素耐药株rpsL基因43位密码子发生突变(16/30),为常见的突变类型(AAG→AGG),5株88位密码子发生突变(5/30),突变类型为(AAG→AGG),5株链霉素耐药株rrS基因发生突变(5/30),突变位点在491处核苷酸位点上(C→T)。
结论:新疆部分地区结核分枝杆菌对链霉素的耐药机制,与rpsL和rrS基因的点突变有关,主要为rpsL基因43位和88位及rrS基因530环处碱基对的改变。rpsL基因在43位和88位的突变是引起结核分枝杆菌对链霉素高度耐药的主要位点,且rrS基因突变的菌株都是对链霉素低度耐药的菌株。不排除有特殊位点和其他耐药分子机制的可能.